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目的:1.探究LPA诱导神经元样PC12细胞凋亡的分子机制。2.探究LPA受体(LPA1和LPA2)和MAPK通路(ERK1/2、p38和JNK)在LPA诱导的神经元样PC12细胞凋亡中的作用3.提出有效阻断LPA诱导的神经元样PC12细胞凋亡的干预措施。方法:将经神经生长因子诱导分化的神经元样PC12细胞分别种在96孔板、24孔板、6孔板或6cm皿中培养。PC12细胞经三种方式处理。处理方式一:用不同浓度(0μM、20μM、40μM、60μM)的LPA处理PC12细胞24h后用于后续实验;处理方式二:用60μM的LPA处理PC12细胞不同时间(0h、6h、12h、24h)后用于后续实验;处理方式三:用dmso(vehicle)、LPA1抑制剂(AM095,5μM)、LPA2抑制剂(LPA2 antagonist 1,5μM)、ERK1/2抑制剂(U0126,5μM)、p38抑制剂(SB203580,8μM)和JNK抑制剂(SP600125,10μM)预处理PC12细胞两小时,然后加入LPA,使所有组的LPA浓度均为60μM,再孵育24h,处理完毕后用于后续实验。后续实验:CCK-8法检测PC12细胞的细胞活力;TUNEL染色检测PC12细胞的凋亡;罗丹明123染色检测PC12细胞的线粒体膜电位;Western Blot检测PC12细胞的Bcl2蛋白水平和确定Bcl2/Bax比率;实时定量PCR检测PC12细胞的Bcl2 m RNA水平。结果:1.LPA以浓度依赖和时间依赖的方式使PC12细胞的线粒体膜电位降低、凋亡比率增加和细胞活力降低。2.LPA以浓度依赖和时间依赖的方式下调了PC12细胞的抗凋亡蛋白Bcl2m RNA水平、Bcl2蛋白水平和Bcl2/Bax比率,增加Bax向线粒体的转位。3.LPA受体(LPA1和LPA2)抑制剂和MAPK通路(ERK1/2、p38和JNK)抑制剂均能阻断LPA诱导的PC12细胞的细胞活力的下降,其中LPA2抑制剂、p38抑制剂和JNK的阻断效果较好,LPA1抑制剂和ERK1/2的阻断效果最差。4.LPA受体(LPA1和LPA2)抑制剂和MAPK通路(ERK1/2、p38和JNK)抑制剂均能阻断LPA诱导的PC12细胞的线粒体膜电位的下降和凋亡比率的增加。其中,LPA2抑制剂、ERK1/2抑制剂、p38抑制剂和JNK抑制剂阻断效果较好,LPA1抑制剂的阻断效果最差。5.LPA受体(LPA1和LPA2)抑制剂和MAPK通路(ERK1/2、p38和JNK)抑制剂均能阻断LPA诱导的Bcl2 m RNA水平、Bcl2蛋白水平和Bcl2/Bax比率的下调以及Bax向线粒体的转位。其中,LPA2抑制剂、ERK1/2抑制剂、p38抑制剂和JNK抑制剂阻断效果较好,LPA1抑制剂的阻断效果最差。结论:1.LPA下调了PC12细胞的Bcl2 m RNA水平,进而降低了抗凋亡蛋白Bcl2蛋白水平及Bcl2/Bax比率,这促进了Bax向线粒体的转位,从而引起了细胞线粒体功能障碍,最终导致了PC12细胞的凋亡比率的增加。2.LPA受体(LPA1和LPA2)抑制剂和MAPK通路(ERK1/2、p38和JNK)抑制剂均能阻断LPA诱导的PC12细胞的Bcl2 m RNA水平的下降,进而减轻了Bcl2蛋白水平和Bcl2/Bax比率的下调,从而阻断了Bax向线粒体的转位,因而减轻了PC12细胞线粒体功能障碍,最终降低了PC12细胞的凋亡比率。其中,LPA2抑制剂、ERK1/2抑制剂、p38抑制剂和JNK抑制剂阻断效果较好,LPA1抑制剂的阻断效果最差。3.LPA以浓度依赖和时间依赖的方式使PC12细胞的细胞活力下降,而LPA受体(LPA1和LPA2)和MAPK(ERK1/2、p38和JNK)通路抑制剂均能阻断LPA诱导的PC12细胞的细胞活力的下降。在本文中,PC12细胞活力的高低基本与细胞凋亡率成负相关。然而,本文也提示细胞活力似乎是一个多因素相关的指标。例如,在本文中的实验条件下,ERK1/2特异性抑制剂能够明显阻断LPA诱导的PC12细胞凋亡,但对于LPA诱导的PC12细胞活力下降的阻断效果却十分有限。