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目的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, Pa)是一种临床上常见的可引起严重院内获得性感染的条件致病菌,由于其固有与获得性耐药,使治疗成为一大难题。亚胺培南(imipenem,IPM)是临床铜绿假单胞菌抗感染治疗的常用碳青霉烯类抗生素,应用广泛,随之引起的耐药菌株也逐渐上升,而耐碳青霉烯类抗生素的Pa往往都是多重耐药株,给临床的抗感染治疗带来很大的困扰。本研究通过对从临床标本中分离的亚胺培南耐药铜绿假单胞菌(imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa, IRPa)的耐药特征进行分析、检测相关耐药基因以及整合子携带的耐药基因等,初步探讨铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的分子机制,从而了解不同的耐药机制间相互作用的规律以及耐药基因在菌株间水平传播的特点,为指导临床用药提供帮助。方法1、药敏实验和三维实验收集2003～2007年临床分离的220株Pa,对这些菌株采用K-B法测定10种临床常用抗生素的药敏情况,同时采用琼脂稀释法检测亚胺培南的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC),筛选出对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌,并分析其对其它抗生素的药物敏感率;采用三维实验的方法分析220株Pa产β内酰胺酶的类型。2、碳青霉烯类水解酶和oprD2蛋白的检测针对鉴定的IRPa菌株,采用普通PCR方法检测具有碳青霉烯水解作用的β内酰胺酶耐药基因(GES、KPC、SPM、VIM、IMP、GIM基因)和oprD2基因,采用多重PCR的方法检测OXA型基因和质粒携带的AmpC酶基因,用荧光定量RT-PCR方法检测oprD2蛋白基因表达情况;同时对产AmpC酶的Pa(25株,含IMP耐药和敏感株)用RT-PCR方法检测AmpC酶基因的表达量情况。3.整合子的鉴定与分析利用整合酶基因PCR-RFLP方法筛选携带整合子的菌株,并对这些整合子进行分类;整合酶阳性菌株用普通PCR扩增检测整合子的qacE△1-sull基因和整合子可变区的耐药基因盒,并对整合子可变区扩增产物进行测序及序列分析。探讨整合子携带的耐药基因盒是否介导铜绿假单胞菌对IPM的耐药。结果1.共筛选出IRPa菌株74株,IRPa对美罗培南、三代头孢类抗生素、氨曲南药物的耐药率都超过50%以上,特别是对头孢噻肟的耐药率达到81.08%,而对多黏菌素B、氨基糖苷类药物和环丙沙星的敏感率相对较高,多粘菌素B的敏感率为100%,阿米卡星为70.27%,庆大霉素为62.16%,环丙沙星为51.35%。2.本次试验共检测到产β内酰胺酶菌株43株,β内酰胺酶的检出率为19.55%(43/220),其中产AmpC酶、超广谱β内酰胺酶(extending spectrum beta-lactamases, ESBLs)、金属酶(metallo beta-lactamase, MBL)、同时产生AmpC和ESBLs两种酶(SSBLs)、未知酶型铜绿假单胞菌的构成比分别是58.14% (25/43)、18.6%(8/43)、4.65%(2/43)、2.33%(1/43)和16.28%(7/43)。43株产酶菌株中对IPM耐药的产酶株共有26株,这26株菌中除了产金属酶(2株)与未知酶型菌株(7株)之外,其余均为产AmpC酶菌株,共17株,占总数的65.4%(17/26)。通过检测AmpC酶对亚胺培南的水解实验可以发现,有7株菌所产的AmpC酶可能对IPM有一定的水解作用。3.PCR和多重PCR检测铜绿假单胞菌IPM耐药相关β内酰胺酶基因,除I1197这株菌DHA基因检测结果为阳性,测序结果为DHA-1外,其余菌株IPM耐药相关β内酰胺酶基因PCR结果均为阴性;oprD2基因检测为阴性的菌株有40株,占IRPa总数的54.05%(40/74)。4.荧光定量RT-PCR对IRPa的oprD2基因表达蛋白量的检测,其结果与普通PCR检测结果相比较,大部分菌株的检测结果两者相一致;25株产AmpC酶阳性菌均有不同程度AmpC酶基因表达量升高,其中,1株携带DHA质粒型AmpC酶基因,12株菌OprD2基因表达量减低,这些菌株均对亚胺培南耐药,13株菌OprD2基因表达量正常,其中仅5株菌对亚胺培南耐药;粗提酶能微弱水解IPM的7株菌,其AmpC酶基因的表达量均有明显升高,其中5株菌同时伴有oprD2基因表达量降低。5.74株IRPa中检出16株(22.86%)携带整合酶基因,这些基因的PCR扩增产物用限制性内切酶HinfI酶切分析,均为I类整合子,并且qacE△1-sull基因扩增均为阳性。16株整合酶基因阳性的IRPa中,有14例检出整合子可变区,共得到7种整合子耐药基因盒的组合形式,这7种组合均携带有氨基糖苷类修饰酶基因,有些携带β内酰胺酶基因及未知功能的基因。其中有4种为新发现的整合子可变区组合:①aac(6)-II-catB3-ORFII-ORFIII组合与②aac(6)-II -unknown-CatB3组合有相同的耐药基因aac(6)-II和catB3,aac6-II基因编码对阿米卡星、奈替米星和妥布霉素的耐药;catB3基因编码氯乙酰基转移酶,介导对氯霉素的耐药;ORFII基因编码的蛋白质可能是一种以RNA为模板的DNA聚合酶,也就是逆转录酶;unknown基因可能是一种新的转座酶基因。③blaIMP-9-aacA4-OXA-10 -aadA2-like组合,IMP-9是金属酶基因,编码对碳青霉烯类药物的耐药;aacA4基因编码氨基葡糖苷6-N-乙酰基转移酶,产生对氨基糖苷类药物的耐药,OXA-10β内酰胺酶基因编码对头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南的低水平耐药; aadA2基因编码对大观霉素和链霉素的耐药。④aac(6)-II-blaP1b-aadA2组合,其中blaP1b基因编码对羧苄青霉素的耐药。这些新发现的基因组合已在NCBI(美国国家生物技术信息中心网站)的Genebank上登录,登陆序列号分别为FJ917747、FJ817422、FJ655384和FJ958368、FJ817423。结论1.耐亚胺培南的铜绿假单胞菌对多种抗生素呈多重耐药和交叉耐药。针对IRPa引起的感染,临床医生可根据病人具体情况,使用敏感性相对较高的抗生素进行治疗,如环丙沙星或氨基糖苷类药物,对于泛耐药的菌株可将多粘菌素B作为经验用药的选择之一。2.在产β内酰胺酶的菌株中,产AmpC酶的菌株检出率是最高的,在产AmpC酶的铜绿假单胞菌中,存在一定数量(28%)能产生水解IMP的AmpC酶菌株,AmpC酶水解IMP可能与Pa菌株的产酶量有关,说明AmpC酶的存在可能是铜绿假单胞菌对三代头孢类抗生素以及IPM耐药的一个重要因素。3.oprD2蛋白的突变或表达量降低是IRPa对IPM耐药的主要原因;无论Pa AmpC酶的表达量是高还是低,如果合并有oprD2基因表达量减少或缺失,均会导致其对亚胺培南耐药;如果仅产生AmpC酶,但oprD2基因表达量正常,大部分菌株对亚胺培南敏感,小部分菌株可通过产酶或其它的机制对IMP耐药。总的来说,产AmpC酶铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药可能是AmpC酶表达量增加和oprD2表达量减低共同作用的结果,而oprD2蛋白缺失的作用可能更为突出。4.整合酶阳性的IRPa中,仅检出I类整合子,未发现其它类型整合子。在这些I类整合子中,共有7种整合子耐药基因盒的组合形式,其中仅两株IRPa的I类整合子中携带的IMP-9基因与IPM的耐药有关,其它菌株的整合子中未检测到相关的碳青霉烯类β内酰胺酶的基因盒,其携带的基因盒主要是介导Pa对氨基糖苷类与其它β内酰胺类抗生素耐药,这些不同I类整合子可变区耐药基因盒组合可能是铜绿假单胞菌表现为多重耐药性的物质基础,还有一些编码未知功能蛋白质的基因盒有待进一步的研究。