【摘 要】
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目的:由于遗传背景完全相同而抗辐射性不同的两个细胞株(A1-5、B4)之间AA12蛋白差异表达.该实验采用组氨酸标签融合蛋白表达AA12蛋白的片段LG21蛋白,制备抗体,并验证细胞周期
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目的:由于遗传背景完全相同而抗辐射性不同的两个细胞株(A1-5、B4)之间AA12蛋白差异表达.该实验采用组氨酸标签融合蛋白表达AA12蛋白的片段LG21蛋白,制备抗体,并验证细胞周期检查点蛋白与AA12蛋白在体内的相互作用,为进一步分析A1-5细胞抗辐射性的分子机理奠定基础.材料与方法:通过PCR技术从AA12基因上扩增出LG21基因片段(100bp-498bp).并且克隆到原核表达载体pET28a+上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,于30℃用1.0mmol/L IPTG诱导LG21蛋白可溶性表达,超声波破碎菌体,离心分离含可溶蛋白的上清,用镍离子螯和柱(Ni-NTA)纯化LG21蛋白,分离纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.Western blot验证抗体特异性,ELISA方法检测抗体效价.利用自制的抗LG21抗体与抗CHK-1抗体与这两株细胞全细胞蛋白进行免疫共沉淀实验.结果:经SDS-PAGE观察在相对分子量20000处可以见到纯化的LG21蛋白条带.Western blot结果表明抗体可以与LG21蛋白特异结合,ELISA检测效价可达到1:163840,在Al-5细胞中进行的免疫共沉淀实验结果阳性,说明CHK-1蛋白与AA12蛋白在体内存在相互作用.结论:该实验通过制备抗LG21的多克隆抗体,并用此抗体在A1-5细胞中进行了免疫共沉淀实验,免疫共沉淀结果表明CHK-1蛋白与AA12蛋白在哺乳动物细胞水平存在相互作用.表明Al-5细胞的强抗辐射性可能是由于CHK-1蛋白与AA12蛋白相互作用,启动了Chk-1/Cdc25C/Cdc2途径,导致G2期延迟,细胞修复辐射损伤作用增强所导致.为进一步研究新基因AA12的功能奠定基础.
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