艾克曼菌（Akkermansia Muciniphila）是一种广泛遍布于动物体内的革兰氏阴性菌,在人体内丰度约为1%-5%,它可能通过与宿主沟通,从而表现出潜在的抗炎反应和免疫应答,促进肠道屏障保护机制,并可能调节肠道内微生物菌群,进而对体内微生态稳定性产生影响。粘蛋白作为艾克曼菌唯一的碳源,其可以通过分泌β-N-乙酰氨基己糖糖苷酶,将粘蛋白降解成N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、硫酸盐等,并提供艾克曼菌生存所需的能量。本研究通过对艾克曼菌属的基因分析,并结合生物信息学手段确定了两种β-N-乙酰氨基己糖糖苷酶,并根据其基因编号分别命名为Am2301和Am2136。将重组蛋白Am2301和Am2136在原核表达系统中异源表达,随后借助镍柱亲和层析和凝胶过滤层析法,成功将Am2301和Am2136进行制备。通过SDS-PAGE和分子筛结果分析确定,样品纯度好、比较均一,可以进行酶学特性和结构及催化机制研究。本研究通过选择四种不同的酶反应底物,分别是p NP-β-Gal NAc、pNP-β-GlcNAc、p NP-α-Gal NAc和p NP-α-Glc NAc,进行底物特异性研究。结果表明:艾克曼菌属重组蛋白Am2301和Am2136均在以β键连接的己糖胺底物时,其酶催化效率最高;而在以α键连接的己糖胺时,没有测定出酶催化活性,说明重组蛋白Am2301和Am2136能够特异性地对以β键连接的N-乙酰己糖胺进行酶促反应。在底物为pNP-β-GlcNAc下,进行了其酶学特性研究,其中重组蛋白Am2301的最适pH为7.0,最适温度为37℃,并且适量Zn2+的存在能够一定程度上提高其酶催化效率,而Mg2+,Ca2+和Mn2+的存在一定程度上抑制了酶催化活性。重组蛋白Am2136在p H为7.5,以及25-40℃温度范围内均能维持较高酶活;与Am2301不同的是,在加入一定量的Ca2+,Mn2+,Zn2+后,其比酶活有一定的降低,说明这些离子对酶促反应可能有一定消极的影响,尤其是加入Zn离子后,酶完全失活。之后,在最适底物pNP-β-GlcNAc条件下,我们对艾克曼菌属Am2301和Am2136进行酶学特性分析,并且结合突变体分析,对催化活性位点进行了确认。首先,与野生型重组蛋白酶催化效率相比,将活性位点氨基酸突变后,其催化效率均下降明显。对于Am2301而言,D278A,E279A和Y373F突变体酶催化效率分别降低了约2600倍、3500倍和1226倍;而Am2136的D412A和E413A突变体酶催化效率分别降低了约4297倍和210倍,说明在艾克曼菌属重组蛋白Am2301和Am2136酶催化过程中,活性位点中心的两个非常保守的氨基酸-天冬氨酸和谷氨酸,均起着重要的作用。随后,我们对Am2301和Am2136蛋白进行了晶体生长工作,最终均获得了质量较好的晶体,分别收到了1.80（?）和1.60（?）的高分辨率数据。晶体结构解析过程中,与已报道的结构相比,Am2301序列同源度为35%,因此采用分子置换法得到了Am2301的晶体结构;通过硒代甲硫氨酸法解决Am2136的相位问题,最终得到了蛋白结构。最后,我们对重组蛋白Am2301和Am2136的结构进行分析,以研究艾克曼菌属β-N-乙酰氨基己糖糖苷酶结构特性和催化机制。结果显示:艾克曼菌属Am2301和Am2136的催化结构域是经典的（β/α）8TIM桶结构域,而且非常保守,其底物结合口袋就位于TIM桶的中心位置。对Am2301和Am2136与Glc NAc的复合物结构进行分析,可以看到Glc NAc是通过与活性位点临近的氨基酸残基形成氢键作用和疏水作用,稳定地结合在活性口袋内。底物的C-2乙酰氨基基团的活性氧作为催化亲核基团,攻击活性位点氨基酸,此时活性位点的氨基酸侧链形成一个共价键,而作用底物以恶唑啉中间体的形式存在,这种催化机制为底物辅助催化机制。借助于三维结构预测软件-SWISS-MODEL,对艾克曼菌属其余9种β-N-乙酰氨基己糖糖苷酶了预测,并对预测的结构进行了结构比对,发现其催化结构域均非常保守,这一保守催化结构域对于维持其酶学性质起到非常重要的作用。综上所述,本研究是首次采用结构生物学手段对艾克曼菌属β-N-乙酰氨基己糖糖苷酶的结构和功能进行了深入的研究,也是艾克曼菌关键蛋白的第一个晶体结构,对于进一步研究β-N-乙酰氨基己糖糖苷酶在艾克曼菌维持生长繁殖、促进肠道屏障保护机制、调节宿主代谢紊乱方面和维持微生态稳定性的作用具有重要意义。