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目的:研究脑缺血再灌注中TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)蛋白的变化对自噬的调节及相应的分子机制。方法:采用小鼠短暂性大脑中动脉阻塞再灌注(transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型和体外培养原代神经元缺糖缺氧再复糖复氧(Oxygen and Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R)模型。用Western blot法检测缺血再灌不同时间点后,小鼠大脑皮层和原代神经元中TIGAR以及自噬相关蛋白LC3,Beclin1和P62等蛋白的表达变化。然后取TIGAR转基因鼠在3 h即TIGAR升至最高的复灌时间点进一步检测自噬的相关变化,检测m TOR-S6K通路蛋白的相关变化,从而检测TIGAR对自噬的影响。在体外培养原代神经元中,构建TIGAR慢病毒感染原代皮层神经元细胞敲除TIGAR蛋白,首先用荧光显微镜观察慢病毒的转染率。用Western blot法检测TIGAR,LC3,Beclin1蛋白的水平。然后提前4 h给予抗氧化剂NADPH(10μM),检测细胞LC3和TIGAR蛋白的表达水平,从而检测给予抗氧化剂后TIGAR对自噬的影响。结果:C57小鼠在脑缺血再灌注后,检测LC3,Beclin1和p62蛋白的表达,统计结果表明在脑缺血再灌注后自噬水平显著提高,且在3 h和6 h达到峰值;TG-TIGAR转基因鼠在脑缺血再灌注后,检测LC3,Beclin1和P62蛋白的表达,统计结果表明自噬也在再灌注后增加,但增加幅度较前者降低。原代皮层神经元在OGD/R后,自噬水平也显著提高,在6 h升至顶峰,此外TAGAR水平在3 h最高。在原代神经元中用慢病毒敲除TIGAR,并复灌6 h和12 h后,自噬被激活(P<0.05)然后,在缺血2 h复灌3 h后检测KO-TIGAR和TG-TIGAR小鼠的自噬情况。在正常条件下,与WT小鼠相比,TG-TIGAR小鼠TIGAR,p-m TOR和p-S6K蛋白表达显著增加(P<0.05),LC3-II蛋白水平显著降低(P<0.05),m TOR和S6K蛋白水平没变化;缺血再灌注3 h后,与WT小鼠相比,TG-TIGAR小鼠显著促进了TIGAR,p-m TOR和p-S6K蛋白水平上调;抑制了LC3-II蛋白水平降低。在敲除TIGAR组中,在正常条件下,与WT小鼠相比,KO-TIGAR小鼠组TIGAR,p-m TOR和p-S6K蛋白表达明显地减少(P<0.001,P<0.001,P<0.05),LC3-II蛋白水平显著地增加(P<0.05),缺血再灌注3 h后,与WT小鼠相比,KO-TIGAR小鼠显著抑制了TIGAR,p-m TOR和p-S6K蛋白水平降低,促进了LC3-II蛋白水平上调。在正常和缺血条件下,与WT小鼠相比,TG-TIGAR小鼠组和KO-TIGAR小鼠组m TOR,S6K蛋白水平没有改变。过表达TIGAR在再灌注3和12 h后显著减少自噬激活的幅度,说明了缺血再灌后TIGAR可抑制自噬的过度激活,与此相反,敲除TIGAR显著地提高了自噬活化,并且TIGAR表达与p-m TOR和p-S6K的水平相关。在敲除TIGAR后自噬被过度激活了。在原代神经元上提前4 h给予抗氧化剂烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH(10μM)然后进行OGD/R,检测细胞LC3和TIGAR蛋白的表达水平,发现LC3和TIGAR蛋白水平均下降(P<0.001,P<0.05),给予NADPH可以部分抑制自噬的过度激活,这些可能说明了TIGAR是通过产生NADPH在缺血/再灌注中对自噬的活化起抑制作用。结论:在本实验中我们证实了,自噬在C57型和转基因TG-TIGAR小鼠中被激活。在敲除TIGAR的条件下OGD复灌3 h和12 h后自噬被激活。在转基因TG-TIGAR小鼠中,过表达TIGAR在再灌注3和12 h后显著减少自噬激活的幅度。与此相反,敲除TIGAR显著地提高了自噬激活。TIGAR的表达水平与p-m TOR和p-S6K的水平相关。用慢病毒敲除TIGAR后,给予烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)抑制了自噬的过度激活。这些结果表明了TIGAR通过产生NADPH在缺血/再灌注中对自噬的活化起抑制作用。