细胞色素P450同工酶属于血红蛋白超家族,是参与催化众多外源物和内源物生物转化反应的重要酶系,主要存在于肝脏中。细胞色素P450酶系催化致癌物、环境污染物以及药物的代谢,使这些化合物亲水性或极性增加,促进排泄,防止毒性物质在体内累积。其中CYP1、2、3族负责大多数外源物的代谢,具有广泛的底物特异性。细胞色素P450 2B6,简称CYP2B6,是研究相对较少的同工酶,主要原因是一方面该酶在人肝中的mRNA水平和蛋白质含量比较低,另一方面是缺乏合适的探针工具。随着高灵敏度和选择性的免疫检测方法的应用,人们在人肝中检测到CYP2B6较高的表达水平。近年来CYP2B6引起了更多的关注,越来越多的数据表明CYP2B6参与催化许多重要临床药物的代谢。其中安非他酮是CYP2B6的特异性药物,可作为酶活性测定的探针底物。体外表达CYP2B6重组酶对研究该酶在药物代谢中的作用具有重要意义。近年来杆状病毒介导的昆虫表达系统得到了广泛地应用,本课题通过该系统表达CYP2B6重组酶,并进行活性鉴定。 1.CYP2B6基因的克隆 根据基因库CYP2B6的cDNA序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到CYP2B6的cDNA基因片段,cDNA片段与pGEM-T载体连接,重组质粒进行DNA测序。通过定点突变方法获得野生型基因序列,经测序的CYP2B6基因片段亚克隆到穿梭载体pFastBac载体上,该载体能够与Bacmid发生特定位点的转座重组。连接后的重组质粒CYP2B6-pFastBac转化到含有Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白筛选获得含有CYP2B6基因片段的重组粘粒,该重组粘粒通过脂质体法转染昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。 2.CYP2B6同工酶与CYPOR的共表达