促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-Releasing Hormone,CRH)及其家族肽是调节中枢和外周神经系统十分重要的神经肽类激素。在1981年Vale从绵羊下丘脑中纯化提取出CRH并明确其受体之后,一系列能够与CRH受体结合的配体也陆续被发现,命名为Urocortin1(UCN1),Urocortin2(UCN2)和Urocortin3(UCN3),这些配体在氨基酸肽链结构上与CRH十分相似。CRH的经典作用是由下丘脑室旁核细胞分泌启动应激过程中神经激素的反应,即启动下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic pituitary adrenal axis,HPA axis)轴。在大脑中,CRH不仅由下丘脑分泌,在中枢神经系统的其他脑区也发现了表达CRH的神经元,如杏仁核、基底核和海马等。近年来越来越多的研究发现CRH及其家族肽可以通过非HPA轴的活动影响中枢神经系统的突触传递过程,而突触形态和功能的异常是许多精神类疾病如精神分裂症和神经类疾病如阿尔茨海默症发病的最主要的原因之一。在哺乳动物体内,CRH受体分为两型,促肾上腺皮质激素释放激素Ⅰ型受体(Corticotropin-Releasing Hormone Receptor Type I,CRHR1)和促肾上腺皮质激素释放激素Ⅱ型受体(Corticotropin-Releasing Hormone Receptor Type II,CRHR2),这两种受体之间存在70%的序列同源性。CRH受体属于G蛋白偶联受体家族,可与G蛋白家族中多种亚基结合激活下游不同的信号通路和激酶介导不同的作用。CRH两型受体与不同配体的亲和力并不相同。CRH与CRHR1的亲和力远高于CRHR2;UCN1与CRHR1和CRHR2都有很高的亲和力;而UCN2和UCN3仅能与CRHR2结合。CRHR1和CRHR2在中枢神经系统中的分布也并不相同,CRH受体在大脑中分布区域的不同以及它们与不同配体之间亲和力的不同是决定CRH及其家族肽作用的关键。海马是一个复杂的有着高度组织能力的脑区,其功能涉及编码、储存和检索信息、调节学习记忆、情绪反应等。海马脑区密集的分布着许多应激激素的受体,因此它对应激反应十分敏感。已证实海马脑区能够合成和分泌CRH,并且其两型受体CRHR1和CRHR2在海马脑区也都有广泛表达,提示CRH对调节海马结构和功能都十分重要。研究发现,应激对于海马学习记忆过程的调控很大一部分是通过改变海马神经元的结构来实现的。突触是介导神经元和靶细胞信息传递的重要结构,是神经系统执行各种功能的基础。研究表明应激可导致海马脑区突触形态发生改变,进一步影响海马认知、情绪反应和学习记忆等功能,并且在这一过程中CRH发挥了十分重要的作用。但目前这一调节机制仍未阐明。大量的临床调查显示妊娠期受到应激刺激会导致子代成年后罹患精神类疾病,如抑郁症和焦虑症等的概率增加,而母体糖皮质激素水平的升高在这一过程中起到了关键作用。研究表明,在大鼠妊娠中晚期给予持续糖皮质激素注射会导致子一代大鼠抑郁样行为增加,海马依赖性空间学习记忆能力受到损伤,并伴随着子一代大鼠海马脑区CRH的水平的升高以及CRHR1的激活。但这一模型中海马脑区结构异常和功能损伤是否与海马脑区高水平的CRH有关,激活的CRHR1是否是介导这一作用的关键受体仍未见报道。因此在本课题的第一部分,我们构建妊娠中晚期接触糖皮质激素的子一代大鼠模型,并给予CRHR1特异性拮抗剂早期持续性干预,观察子一代大鼠海马依赖性空间学习记忆能力的改变及海马突触形成的变化,明确CRH/CRHR1在调节海马依赖性空间学习记忆能力及突触形成中的作用。并且通过离体培养海马脑片、单独培养神经元、神经元与胶质细胞共培养等多种培养体系探讨CRH调节海马突触形成的分子机制。研究证实在应激反应过程中,CRHR1和CRHR2两型受体介导的作用并不相同。如在CRHR1基因敲除的小鼠中,CRHR1的缺失可以逆转慢性应激对海马CA3区树突分支以及海马依赖性空间学习记忆能力的损伤;而CRHR2敲除小鼠则表现出焦虑样行为的增加。提示CRH两型受体在应激反应以及一些其他的生理功能上可能都发挥着不同的作用。UCN2和UCN3都能够特异性的与CRHR2结合,但发挥的作用可能并不相同,但有关UCN2和UCN3对海马突触形成的研究仍未见报道。因此在本课题的第二部分实验中,我们用一系列的实验阐明UCN2和UCN3对海马突触形成的调节作用及分子机制。主要实验结果如下:一、促肾上腺皮质激素释放激素Ⅰ型受体对海马依赖性空间学习记忆能力及突触形成的调节作用(一)促肾上腺皮质激素释放激素Ⅰ型受体对妊娠中晚期接触糖皮质激素子一代大鼠海马依赖性空间学习记忆能力及突触形成的调节作用。1.妊娠中晚期接触糖皮质激素子一代大鼠在Morris水迷宫行为测试中表现出海马依赖性空间记忆的获取和记忆保持能力的缺陷,并伴随着海马CRH水平的显著升高和CRHR1的激活。2.给予妊娠期接触糖皮质激素子一代大鼠CRHR1特异性拮抗剂CP154526或antalarmin早期持续性干预可以阻断的海马脑区CRH和CRHR1水平的升高,并改善子一代大鼠海马依赖性空间学习记忆能力的缺陷。3.妊娠期接触糖皮质激素子一代大鼠海马脑区CRH水平的升高及CRHR1的激活抑制海马CA1区以突触素I(synapsin I)和突触后致密蛋白95(postsynapticdensity 95,PSD95)为标记的突触末梢的形成。这一作用可被CRHR1特异性拮抗剂CP154526或antalarmin早期持续性干预逆转。(二)促肾上腺皮质激素释放激素Ⅰ型受体对海马突触形成调节的分子机制1.CRH处理离体培养海马脑片48小时可抑制海马脑片synapsin I和PSD95的表达,并可被CRHR1特异性拮抗剂antalarmin逆转。2.CRH处理48小时后,海马神经元以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢的数目显著增多,并被antalarmin阻断。3.CRH处理离体培养胶质细胞与海马神经元共培养体系48小时,海马神经元上以synapsin I和PSD95的标记的突触末梢显著减少,与海马脑片结果一致。4.CRH处理胶质细胞48小时收集其上清孵育神经元,神经元上以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢的数目明显减少,并被antalarmin逆转,与海马脑片和共培养体系结果一致。5.高通量细胞因子检测胶质细胞上清中34种大鼠细胞因子,结果显示CRH处理的胶质细胞上清趋化因子5(C-X-C motif chemokine 5,CXCL5/LIX)水平显著降低并可被antalarmin逆转。ELISA检测进一步证实CRH通过CRHR1抑制胶质细胞和脑片CXCL5/LIX的分泌。外源性的补充CXCL5/LIX可以逆转CRH处理的胶质细胞上清对海马神经元上以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢的形成的抑制,该作用又可被LIX受体(CXCR2)的拮抗剂SB225610阻断。6.CRH通过与胶质细胞中的CRHR1结合,激活胞内Gi蛋白抑制下游c AMP的生成,同时激活Gq/PLC/PKC信号通路抑制胶质细胞分泌CXCL5/LIX。二、促肾上腺皮质激素释放激素Ⅱ型受体CRHR2对海马突触形成的调节作用1.UCN2处理离体培养海马脑片48小时后海马脑片中synapsin I和PSD95的表达显著升高并可被CRHR2的特异性拮抗剂astressin2B阻断;UCN3处理离体培养海马脑片48小时后海马脑片中synapsin I和PSD95的表达没有明显变化。2.UCN2处理单独培养神经元48小时后,神经元上以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢明显减少,并可被astressin2B逆转。3.UCN2处理胶质细胞与海马神经元共培养体系48小时后,神经元上以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢显著增多,并可被astressin2B逆转,与海马脑片结果一致。4.UCN2处理胶质细胞48小时后收集其上清孵育神经元,神经元上以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢显著增多,与海马脑片和共培养体系结果一致。5.高通量细胞因子检测星形胶质细胞上清中34种大鼠细胞因子,结果显示UCN2处理的胶质细胞上清中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)水平显著升高并可被astressin2B阻断。ELISA检测进一步证实UCN2通过CRHR2促进星形胶质细胞和脑片NGF的分泌;而UCN3对星形胶质细胞和脑片NGF的分泌没有影响。6.NGF可以模拟UN2处理的星形胶质细胞上清对海马神经元上以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢形成的促进,该作用又可被NGF的受体Trk A的阻断剂Trk AIg G或K252a阻断。结论1、CRHR1的激活介导了妊娠期接触糖皮质激素对子一代大鼠海马依赖性空间学习记忆及海马CA1区以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢形成的损伤,给予CRHR1拮抗剂CP154526或antalarmin早期持续性干预可以逆转这一作用。在离体水平上,CRH通过与胶质细胞中的CRHR1结合,激活Gi蛋白,抑制下游c AMP的生成,并且激活Gq/PLC/PKC信号通路抑制胶质细胞分泌CXCL5/LIX,通过改变神经元生长的微环境,抑制神经元上以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢的形成。2、UCN2通过与星形胶质细胞中CRHR2结合,促进星形胶质细胞分泌NGF,通过改变神经元生长的微环境,促进神经元上以synapsin I和PSD95为标记的突触末梢的形成。UCN3对海马脑片中synapsin I和PSD95的表达没有影响,并且不能改变星形胶质细胞NGF的分泌。