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mTORC1（mechanistic/mammalian target of rapamycin complex1）是一种进化上保守的蛋白激酶复合物,是细胞根据环境因素调节代谢水平的一种关键分子。异常的mTORC1调控与多种疾病的发生密切相关,因此解析mTORC1的调控机制具有重要意义。位于溶酶体内的氨基酸是激活mTORC1的一种重要信号分子,但溶酶体内氨基酸水平的调控机制尚缺乏研究。PAT1（proton-coupled amino acid transporter 1）是一个11次跨膜的氨基酸转运蛋白,主要定位于溶酶体,可以通过降低溶酶体内的氨基酸水平来负向调控mTORC1。然而在某些类型的细胞中,PAT1也定位在内体,甚至细胞核中。目前PAT1在细胞内的定位机制还不清楚。前期研究发现,PAT1在溶酶体上的定位受到氨基酸水平的影响而呈现动态变化。为了深入调查PAT1的定位调控机制,及其对调控mTORC1的意义,本项工作以人肾上皮细胞HEK293为主要研究模型,通过调查带有标签分子的PAT1融合蛋白在溶酶体的定位调控机制及其对mTORC1活性的影响,获得如下研究结果:1.以EGFP-PAT1为研究对象,发现该融合蛋白在PAT1氨基端的47TTWF50位点发生剪切,导致PAT1失去位于氨基端的胞内区片段。2.通过氨基酸序列分析,PAT1氨基端的胞内区包含一个经典的酪氨酸类型的溶酶体定位信号,38YQRF41（Yxx（37））。将关键的Y38位点突变为丙氨酸（Y38A）,导致突变的PAT1在溶酶体上表达量降低,而在细胞膜上表达量升高,并且不能抑制mTORC1的活性。这些结果说明38YQRF41参与指导PAT1向溶酶体的运输。3.当外界缺乏氨基酸时,PAT1的剪切被抑制。而氨基酸,或者单独的谷氨酰胺可以诱导PAT1发生剪切。氨基酸可以通过诱导PAT1剪切掉溶酶体定位信号来抑制PAT1定位于溶酶体,促进维持溶酶体内的氨基酸水平。4.通过免疫荧光染色的方法,分析了PAT1蛋白不同区域对其细胞内定位的影响,证明PAT1第二个较大的胞质区对其溶酶体定位具有重要作用。5.位于PAT1第二个胞质区的113FVDY116序列指导PAT1由内质网向高尔基体运输。该序列缺失后,PAT1滞留在内质网。并且过表达该突变体不能抑制mTORC1的活性。6.将PAT1异位表达在线粒体上不能抑制mTORC1的活性,进一步说明PAT1需要定位在溶酶体上发挥抑制mTORC1的作用。综上以上研究结果,本研究获得了两个主要发现。一是发现氨基酸可以诱导PAT1发生氨基端的蛋白剪切,导致PAT1失去一个溶酶体定位信号,38YQRF41,从而抑制PAT1向溶酶体的运输,促进激活mTORC1。二是发现PAT1在第二个胞质区具有重要的溶酶体定位信号。113FVDY116参与指导新合成的PAT1从内质网向高尔基体运输。如果将PAT1滞留在内质网上,或将PAT1异位表达在线粒体上,都不能抑制mTORC1的活性。以上结果对于阐明氨基酸转运蛋白调控mTORC1的机制具有重要的指导意义。