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目的:在细胞水平,研究14-3-3γ蛋白参与内毒素耐受抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的分子机制,即14-3-3γ蛋白是否将phospho-GSK3β靶向定位于胞浆完成对胞浆中β-catenin的调控,从而影响炎症因子的转录,进而起到内毒素耐受抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用。方法:我们采用的是H9c2心肌样细胞,并构建体外的缺氧/复氧损伤模型。将H9c2细胞分5组进行实验操作:Control(正常对照组);A/R(缺氧/复氧组);LPS+A/R(脂多糖+A/R组);NC+LPS+A/R(阴性对照+脂多糖+A/R组);siRNA14-3-3γ+LPS+A/R(siRNA14-3-3γ+脂多糖+A/R组)。1.通过生物公司构建了三种具有基因序列高选择性的siRNA-14-3-3γ慢病毒,我们将带荧光(GFP)的阴性对照(negative control,简称NC)病毒,首先感染H9c2心肌样细胞,然后在荧光倒置显微镜下观察NC荧光表达,进而筛选出病毒的复感染指数(MOI值)以及感染体系,并采用Western Blotting法从三种序列中筛选出沉默效果最佳的病毒序列,完成对其的扩增便于后续实验的进行。2.采用CCK-8试剂盒以及流式细胞仪双重筛选合适的LPS浓度,即内毒素耐受保护模型的建立;并用Western Blotting法验证14-3-3γ蛋白在发挥内毒素耐受保护过程中表达量是否增加。3.采用免疫共沉淀(Co-IP)检测在内毒素耐受保护心肌缺氧/复氧损伤过程中与14-3-3γ相互作用的配体蛋白,即GSK3蛋白亚型的确认。免疫荧光(IF)验证在内毒素耐受保护抗心肌缺氧/复氧损伤过程中14-3-3γ蛋白与其配体蛋白的亚细胞定位趋势是否一致。4.Western Blotting法观察β-catenin蛋白在不同干预下的表达情况,CCK-8试剂盒测定每组心肌样细胞的存活率;各组的细胞凋亡程度、活性氧(ROS)水平及线粒体膜电位的变化(Δψm),均是通过购买相应试剂盒并按照说明书的步骤进行操作,最后采用流式细胞仪上机检测;线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的程度、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性也是通过购买相应试剂盒并按照说明书的步骤操作,通过酶标仪上机检测;最后用酶联免疫吸附法(Elisa)检测炎症因子TNF-α以及IL-6的分泌水平。结果:1.筛选出siRNA-14-3-3γ慢病毒沉默效果最佳序列为Ywhag-RNAi(44876-1),阴性对照组慢病毒对14-3-3γ蛋白无明显影响。慢病毒感染的最佳条件:MOI值为20,感染过程中所使用的最佳培养条件为含有10%FBS的DMEM培养基+HiTransG P,感染的最佳时长为72 h。2.经过CCK-8试剂盒以及流式细胞仪分别检测了细胞的存活率以及细胞凋亡程度,结果显示:当我们所使用的LPS浓度为200 ng/mL时,在心肌样细胞缺氧/复氧损伤时出现较好的保护作用,也就说明了我们所建立的内毒素耐受保护模型以及体外的缺氧/复氧损伤模型是成功的。Western Blotting结果显示LPS+A/R、NC+LPS+A/R这两组中的14-3-3γ蛋白含量有所增加,与我们前期实验结果相吻合。3.利用免疫共沉淀(Co-IP)技术,IP:GSK3,IB:14-3-3γ检测到与14-3-3γ蛋白相互作用的GSK3蛋白的亚型为phospho-GSK3β,并且只有在LPS预处理下两者才会出现相互作用;免疫荧光结果显示在内毒素耐受保护心肌细胞缺氧/复氧损伤过程中,phospho-GSK3β的亚细胞定位与14-3-3γ趋势一致,由细胞核向细胞浆转移,并且蛋白含量都有所增加。4.与AR组相比,Western Blotting检测结果显示:LPS+A/R、NC+LPS+A/R的β-catenin蛋白表达水平较高,表明在LPS预处理后β-catenin的蛋白浓度显著升高,进而完成在胞浆中的蓄积转移入细胞核影响炎症因子的转录;CCK-8试剂盒测定结果显示:LPS+A/R、NC+LPS+A/R的细胞存活率显著升高;细胞凋亡程度显著下降;活性氧(ROS)生成水平明显减少;线粒体膜电位变化(Δψm)较稳定;吸光度法测定线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的程度下降、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性下降;最后用酶联免疫吸附法(Elisa)检测炎症因子TNF-α以及IL-6的分泌水平明显减少。结论:内毒素耐受对心肌样细胞在经过缺氧/复氧损伤处理后确实存在保护作用,其机制是小剂量的LPS通过TLR4/PI3K/Akt途径去磷酸化GSK3蛋白,然后大量表达的14-3-3γ协助phospho-GSK3β完成胞浆内亚细胞定位,并进而对Wnt信号通路中的β-catenin蛋白进行胞浆内调控,使β-catenin免遭泛素-蛋白酶系统的降解而在胞浆中大量聚集,β-catenin蛋白含量在胞浆中增加后会促使其本身转移入细胞核并与胞核内的TCF/LEFs结合,调节大量炎性相关基因的转录,从而发挥保护作用。