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目的:根据生物信息学软件预测与Src酪氨酸蛋白激酶及NMDA受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)三种亚基GluN1、GluN2A、GluN2B相互作用的miRNA,对预测到的miR-9a-5p与Src、GluN1、GluN2A、GluN2B在炎性疼痛大鼠下丘脑弓状核(hypothalamic arcuate nucleus,ARC)中的表达以及miR-9a-5p与Src、NMDA受体三种亚基的靶向关系进行研究,从而探讨miR-9a-5p如何通过调控Src、NMDA受体三种亚基参与炎性疼痛,以期在基因水平上找寻出治疗炎性疼痛的新靶点,为新型镇痛药的研发提供实验依据。方法:(1)应用生物信息学软件筛选出与:Src、GluN1、GluN2A、CluN2B四种基因均具有潜在结合位点的miR-9a-5p;(2)大鼠右侧足底注入0.1 ml完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA),建立外周炎性疼痛模型,同时设注射等量生理盐水(normal saline,NS)与不作任何处理的naive组作为对照;(3)采用von Frey法和辐射热-缩腿法测定大鼠机械缩腿阈值(mechanical withdraw threshold,MWT)和热缩爪潜伏期(thermal withdraw latency,TWL)的变化;(4)利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的方法检测CFA造模后大鼠ARC内Src、GluN1、GluN2A、GluN2B mRNA以及miR-9a-5p表达的情况,将miR-9a-5p表达相对量分别与Src、GluN1、GluN24、GluN2B mRNA表达相对量做相关性分析;(5)采用蛋白质免疫印迹的方法(western blot)检测CFA造模后大鼠ARC内Src、GluN1、GluN2A及GluN2B蛋白的表达情况;(6)构建重组质粒,利用双荧光素酶报告基因的方法检验miR-9a-5p与Src、GluN2A和GluN2B的靶向关系;(7)采用免疫荧光(immunofluorescence)的方法检测GluN2A蛋白在ARC中的表达情况;(8)利用miR-9a-5p agomir或miR-9a-5p antagomir激活或阻断大鼠ARC内miR-9a-5p,检测大鼠相应的行为学变化以及GluN2A的mRNA与蛋白表达情况。结果:(1)CFA造模可使大鼠机械缩腿阈值显著降低(MWT:0.47±0.13 g/l天,0.77 ± 0.40g/3天,1.61±0.81 g/5天,2.77 ± 0.75 g/7天,6.48 ± 1.03 g/14天),与对照组相比具有显著的统计学意义(P<0.001)。同样,外周炎症可致大鼠的热痛阈值显著降低(TWL:3.88 ± 0.46 s/l 天,6.38±1.03 s/3 天,8.14±0.73 s/5 天,9.79±1.44 s/7天),与对照组相比具有显著的统计学意义(P<0.001),热痛阈值于第 14天(12.47±1.96 s)恢复正常。(2)大鼠ARC内Src(2.04±0.29)、GluN2A(1.64 ± 0.26)及GluN2B(1.40±0.24)mRNA表达水平在CFA造模后第5天均显著升高,与对照组相比具有显著的统计学意义(P<0.001或P<0.01)。但是,GluN1 mRNA(1.55±0.38)表达水平仅在第1天显著升高(P<0.01)。同样,外周炎症可致大鼠ARC内Src(2.31 ± 0.70)、GluNl(2.37±0.59)、GluN2A(2.38±1.04)及GluN2B(1.97±0.26)蛋白表达水平在CFA造模后第5天均显著升高,与对照组相比具有显著的统计学意义(P<0.001或P<0.01)。(3)生物信息学软件预测到miR-9a-5p与Src、GluN1、GluN2A、GluN2B mRNA均具有潜在结合位点。(4)qPCR结果表明CFA炎性疼痛大鼠ARC内miR-9a-5p在第3天(0.75±0.11)、第5天(0.51±0.22)、第7天(0.71±0.09)、第14天(0.79±0.13)表达水平显著下降。其中,miR-9a-5p在CFA造模后第5天降至最低,与对照组相比具有显著的统计学意义(P<0.001或P<0.01)。(5)相关性分析发现miR-9a-5p与GluN1 mRNA的表达无显著相关性,与Src、GluN24、GluN2B mRNA均具有显著相关性(P<0.05)。(6)双荧光素酶报告基因结果显示,miR-9a-5p可直接靶向作用于GluN2A 3’-UTR(0.76±0.18,P<0.001),但不能直接作用于Src与GluN2B 3’-UTR。(7)免疫荧光结果显示,GluN2A在ARC中表达于神经元与小胶质细胞核,不表达于星形胶质细胞。(8)CFA大鼠ARC内微量注射miR-9a-5p agomir可以显著缓解炎性疼痛大鼠的机械痛敏(第一次注射miR-9a-5p agomir 24 h后CFA大鼠MWT从2.38±1.95 g增至5.37 ±2.37 g,第二次注射miR-9a-5p agomir 24 h后MWT增至7.16±2.43 g)。同时,miR-9a-5pagomir可显著降低CFA大鼠ARC内GluN2A mRNA(0.76±0.19)和蛋白(0.78±0.33)表达水平。与对照组相比,机械痛阈、mRNA及蛋白表达水平的变化均具有显著的统计学意义。但是,ARC内微量注射miR-9a-5p agomir对大鼠热痛阈值并未产生显著影响。(9)NS大鼠ARC内微量注射miR-9a-5p antagomir能诱发大鼠出现机械痛敏(第一次注射miR-9a-5p antagomir 24 h后MWT从12.84±2.36 g降低至7.07±1.48 g,第二次注射miR-9a-5p antagomir 24 h后MWT降至5.31±1.31 g),并且miR-9a-5p antagomir可致GluN2A mRNA(1.41 ±0.20)和蛋白(1.36±0.26)表达水平显著升高。与对照组相比,机械痛阈、mRNA及蛋白表达水平均具有显著变化。但是,miR-9a-5p antagomir对热痛阈值并未产生显著影响。结论:外周炎性疼痛大鼠ARC内miR-9a-5p能通过靶向调控GluN2A基因的表达从而发挥镇痛作用,提示miR-9a-5p可作为治疗炎性疼痛的新靶点。