手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）是发生在婴幼儿之间的常见病毒性传染病。早在上个世纪60年代就已经报道了该病的流行,1957年首次对加拿大儿童感染手足口病进行了描述;1958年J.Alsop等从病人的疱疹液中分离出了柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus 16, CA16）;1959年将此类疾病正式命名为“手足口病”;1969年,在美国加利福尼亚分离出首株肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）,之后在世界范围内每年都会有手足口病的流行报道。近几年,手足口病在亚太地区流行呈上升趋势,2008年手足口病在我国大陆地区暴发流行造成了近50万例儿童感染,120例患者死亡,而且手足口病高发期每天都有新增死亡病例出现,引起了全国人民的恐慌。自2008年5月国家将该病列为丙类传染病以来,手足口病发病率和死亡率逐年攀升,成为危害婴幼儿健康和公共卫生安全的重要传染病,日益受到人们的重视。引起手足口病的病原体主要为肠道病毒,其中包括柯萨奇病毒A组（16、4、5、7、9、10型）和B组（2、5、13型）,肠道病毒（68、71型）以及埃可病毒,其中EV71和CA16交替出现,成为我国近几年流行的两种主要病原体。由EV71感染引起的手足口病具有高发病率和死亡率的特征,伴有严重的神经源性并发症,包括病毒性脑膜炎,脑炎,以及脊髓灰质炎样麻痹,引起的肺水肿、肺出血经常导致婴幼儿快速死亡;CA16会引起心肌炎、心包炎等严重疾病,也日益受到重视。EV71病毒划分为A、B、C三个基因型,进一步细分为A,B1–5和C1–4亚型,近年来我国EV71型手足口病的流行以C4亚型为主。机体抵抗EV71感染的免疫应答包括天然免疫应答和特异性免疫应答,其中在特异性免疫应答中由B细胞介导的体液免疫应答在预防与控制EV71感染中占有重要地位。自古以来,疫苗是控制传染病流行最为有效而经济的手段。目前,手足口病疫苗研究以EV71为主。由于EV71致病机制和免疫应答机制尚未阐明,虽然已经开展了多种EV71疫苗的研究,并取得了很大进展,但是至今仍未开发出有医药商业应用价值的疫苗。尽管EV71灭活疫苗相比其它类型的疫苗具有较强的抗病毒保护作用,但是灭活疫苗往往存在比较严重的安全性问题,如核酸残留、免疫过激等,尤其是手足口病疫苗防护的人群主要是婴幼儿,最终能否用于临床仍然不明。EV71 DNA疫苗和亚单位蛋白疫苗免疫保护效果不如灭活苗,离应用有较大距离。近年来,病毒样颗粒疫苗（VLP）为病毒类疫苗研究开辟了新的方向,VLPs疫苗因其缺乏病毒核酸以及颗粒较为完整、抗原表位全面等优点,成为新型疫苗中的一大亮点。目前,以HPV VLP疫苗为代表的病毒样颗粒疫苗已经进入临床应用阶段。手足口病EV71 VLP疫苗研究虽然也有报道,但是缺乏更全面深入的研究。本研究根据近年中国EV71流行株的特点围绕EV71型手足口病VLP疫苗开展了以下几方面的研究,为手足口病疫苗研发提供实验数据,具有非常重要的现实意义。本研究通过免疫学、病毒学、分子流行病学、分子生物学、疫苗学的最新技术,分析EV71型手足口病病毒流行株生物学特征和基因型别,分离、鉴定和筛选EV71疫苗株和攻毒株,并对两者基因组进行生物信息学比较分析;采用昆虫杆状病毒表达系统表达EV71型手足口病VLP蛋白,探索EV71 VLP最新纯化方法,获得纯度较高的EV71 VLP抗原;制备EV71型手足口病VLP疫苗和EV71灭活苗剂型,并对其进行免疫原性和免疫保护性的评价。研究方法:1.将国内近几年手足口病患者临床样本（咽拭子、疱疹液、肛拭子等）处理后接种至Vero细胞,盲传两代后,将出现典型细胞病变的样本依次进行RT-PCR鉴定、蚀斑纯化、滴度测定、电镜观察以及EV71 VP1基因序列同源性比对和进化分析;2.将EV71分离株进行免疫原性、交叉保护性及稳定性评价,筛选疫苗候选株;将EV71分离株脑内注射ICR乳鼠,取能够导致乳鼠发病的EV71毒株在ICR乳鼠上进行传代驯化,筛选致乳鼠稳定发病死亡的攻毒株,建立EV71小鼠感染致病模型;通过反转录获得疫苗候选株和攻毒株的全长cDNA并进行全基因组测序,用生物信息学软件对基因组中关键部位核苷酸序列及氨基酸序列进行比对分析;3.从EV71疫苗候选株中确定1株作为后续研究的疫苗株;提取疫苗株RNA,通过反转录获得全长cDNA,PCR扩增P1和3CD基因,并分别克隆到同一个质粒pFastBacDual上的Pph和P10启动子下游,转化大肠杆菌DH5α感受态,通过蓝白斑筛选阳性重组菌,提取重组Bacmid DNA并转染sf9昆虫细胞,收获重组杆状病毒并进行EV71 VLP蛋白的表达;经SDS-PAGE、WesternBlot、间接免疫荧光实验及透射电镜观察对EV71 VLP蛋白进行全面鉴定;4.通过悬浮培养昆虫细胞sf9进行EV71 VLP的大量表达;通过30KD超滤膜浓缩→30%-60%蔗糖密度梯度离心→DEAE阴离子交换层析→4FF凝胶层析的方法对EV71 VLP进行纯化;通过SDS-PAGE、WesternBlot检测及透射电镜观察初步鉴定抗原纯化效果;5.测定EV71 VLP抗原和EV71灭活全病毒抗原（抗原对照）蛋白含量后,选择氢氧化铝和SP01两种佐剂制备疫苗剂型;将制备的EV71 VLP疫苗和灭活疫苗免疫6-8周龄Balb/c小鼠,通过ELISA、中和试验、脾淋巴细胞增殖试验和脾淋巴细胞亚型分析来综合评价疫苗的免疫原性;通过体外中和试验评价疫苗对现有EV71流行株的交叉保护作用;将EV71 VLP疫苗免疫受孕母鼠,并用EV71攻毒株对新生乳鼠进行攻毒试验,比较小鼠存活率,评价疫苗的免疫保护效果。研究结果:1.从441份临床手足口病患者样本中分离到35株EV71型手足口病病毒(病毒滴度>105CCID₅₀/ml),基于病毒VP1基因的系统进化分析结果,表明本研究分离出的EV71流行株基因型均为C4亚型;筛选到2株EV71疫苗候选株（BJ01和LCH02）,两者在Vero细胞上的病毒滴度均大于10^7.5CCID₅₀/ml,免疫小鼠后血清抗体效价均大于2¹¹,中和抗体效价为2⁸;15代内疫苗候选株的VP1基因序列同源性为99.99%,氨基酸序列同源性为100%;从这2株EV71疫苗候选株中确定其中1株（BJ01）作为疫苗株,另1株（LCH02）作为备选;筛选并驯化出1株EV71攻毒株（LCH01）,攻击1日龄ICR乳鼠后5天开始发病,典型症状为后肢瘫痪,从第6天开始出现死亡,14天后全部死亡,经测定LCH01攻毒株在Vero细胞上的病毒滴度为10⁸CCID₅₀/ml,对1日龄乳鼠的毒力为108^LD₅₀/ml;2.采用昆虫杆状病毒表达系统成功构建重组杆状病毒Baculovirus-P1-3CD,病毒滴度可达108PFU/ml;SDS-PAGE、Westernblot以及间接免疫荧光试验结果均证明了EV71 VLP的表达,透射电镜显示VLP大小在25-30nm之间,与完整的病毒颗粒结构一致;通过超滤浓缩→蔗糖密度梯度离心→阴离子交换层析→凝胶层析纯化EV71 VLP,获得了纯度在95%以上的EV71 VLP抗原;3.本研究选择铝盐和SP01佐剂与EV71 VLP抗原和EV71灭活病毒抗原混合制备疫苗剂型,其中铝盐的使用按常规剂量1mg/ml与抗原进行吸附,SP01佐剂稀释后以等体积与抗原进行吸附,制备出6种候选疫苗剂型;4.本研究制备的VLP疫苗免疫鼠血清中和抗体效价比灭活全病毒疫苗高;含佐剂（铝佐剂或SP01）疫苗比不含佐剂疫苗高;本实验室自制佐剂SP01比铝佐剂更能增强疫苗的免疫效果,血清抗体效价峰值为2¹⁵,中和抗体效价峰值为2¹¹;EV71 VLP疫苗和EV71灭活疫苗免疫小鼠血清均能够高效中和不同时间、不同地区的EV71流行株;ELISA实验测得VLP疫苗组血清中IFN-γ和IL-4水平比灭活疫苗组高,MTT结果表明VLP疫苗相比灭活苗能刺激产生更多特异性脾淋巴细胞,FACS分析结果显示出VLP疫苗能够激发CD4+T细胞的显著上升;5.在攻毒剂量为50 LD₅₀时,疫苗组小鼠存活率均达到100%;而对照组为0%。在攻毒剂量为500 LD₅₀时,VLP+SP01组、VLP +铝佐剂组和EV71+SP01组小鼠存活率分别达到90%,77%和72%;EV71+铝佐剂组、VLP组和EV71灭活全病毒组小鼠存活率分别达到60%,55%和50%,对照组小鼠全部死亡。结论:1.本研究成功筛选出2株免疫原性强、交叉保护好以及稳定性高的毒株作为制备EV71疫苗候选株,其中确定了BJ01株作为本研究用疫苗株,同时筛选出1株滴度高、毒力强的LCH01病毒株作为EV71 VLP疫苗免疫保护性评价的攻毒株;2.本研究采用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VLP蛋白,初步建立了超滤浓缩→蔗糖密度梯度离心→DEAE阴离子交换层析→凝胶层析纯化EV71 VLP的技术,纯度可达95%以上;3.本研究选用铝盐和SP01佐剂成功制备了疫苗剂型,免疫小鼠后,免疫学实验结果表明EV71 VLP疫苗相比灭活苗能激发较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有较强的免疫原性和交叉免疫保护性。两种佐剂均能够增强抗原的免疫应答,其中SP01佐剂增强作用更强。以混合SP01佐剂的EV71 VLP疫苗免疫小鼠能够产生更高的免疫保护效果。