研究背景慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML,简称慢粒)是一种由染色体t(9;22)易位形成BCR-ABL融合基因为特征的骨髓增殖性肿瘤,BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有异常的酪氨酸激酶活性,由此激活下游信号通路导致疾病的发生。慢粒自然病程分为慢性期(Chronic phase,CP)、加速期(Accelerated phase,AP)和急变期(Blastphase,BP)。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)能够抑制BCR-ABL的酪氨酸激酶活性,是慢粒的首选治疗方法,多数慢性期患者应用TKIs治疗后能够长期生存,然而慢粒一旦急变,TKIs疗效不佳,致死率极高,中位生存期仅为6个月。慢粒急变机制复杂,尚未完全阐明,因此解析慢粒急变机制及其关键调控分子,是有效防控慢粒急变的科学前提。慢粒急变是一个多步骤、多变化的过程,由于慢粒急变过程通常伴随BCR-ABL高表达和过度激活状态,不受控制的BCR-ABL激活被认为是促进慢粒急变的驱动力,因此,慢粒急变存在BCR-ABL依赖机制。另外,研究发现,除癌基因的激活或扩增、抑癌基因的功能缺失或者突变等遗传学打击之外,信号通路关键分子调控异常和表观遗传学失衡等也参与慢粒急变,因而慢粒急变还存在BCR-ABL非依赖途径。视网膜母细胞瘤结合蛋白2(RBP2)属于KDM5家族,靶向作用于组蛋白H3第四位赖氨酸(H3-K4)的二甲基化和三甲基化(Me2/Me3),介导组蛋白去甲基化。同时RBP2含有一个组蛋白去甲基化酶标志性基序的JmjC结构域,发挥转录调节功能,从而调控多种细胞生物学过程。近年来,RBP2被报道参与胃癌、肺癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、肾癌、卵巢癌和肝癌等多种肿瘤的发生发展。我们团队在前期研究中发现RBP2在慢粒急变期表达明显下调,通过调控miR-21以BCR-ABL非依赖途径介导慢粒急变的进程。然而,R1BP2是否可以通过BCR-ABL依赖途径介导慢粒急变仍不清楚,值得进一步研究。Lin28B是Lin28家族的一种RNA结合蛋白,可识别结合RNA3’UTR基序,从而调控靶基因的表达,介导多种生物学功能。Lin28B在多种肿瘤中高表达,包括淋巴瘤、神经母细胞瘤,结肠癌和肝癌等。研究发现Lin28B在急性髓系白血病中高表达,通过调控miRNAlet-7促进白血病细胞增殖异常和细胞周期紊乱,且受转录因子NF-κB调控,在白血病干细胞维持中起关键作用,因此具有干预AML潜在靶点的特征。新近研究还发现Lin28B同家族的Lin28A还具有DNA结合蛋白作用。然而,目前在慢粒中尚无Lin28B相关研究,是否在慢粒急变中发挥作用也尚需探究。本研究发现RBP2和Lin28B在慢粒急变中表达异常,通过在细胞分子水平、动物整体水平和人体骨髓组织水平等研究,我们发现组蛋白去甲基化酶RBP2以BCR-ABL依赖的途径、RNA结合蛋白Lin28B调控miR-181d转录以BCR-ABL非依赖的途径促进慢粒急变。此为探究RBP2和Lin28B在慢粒急变中作用及其调控机制提供新的思路。研究目的:(一)探究RBP2在慢粒急变中以BCR-ABL依赖途径介导的效应与机制。(二)探究Lin28B在慢粒急变中以BCR-ABL非依赖途径介导的效应与机制。研究方法和研究结果:(一)组蛋白去甲基化酶RBP2通过调控PTEN以BCR-ABL依赖的途径介导慢粒急变(1)过表达RBP2抑制白血病细胞的增殖在慢粒急变细胞K562和MEG01中转染RBP2过表达质粒,应用EdU细胞增殖实验和软琼脂克隆形成实验检测RBP2对于白血病细胞增殖的作用。结果提示RBP2过表达显著抑制白血病细胞的增殖能力。(2)检测RBP2与BCR-ABL之间的相互作用应用Western blot检测BCR-ABL 阳性细胞系(K562和MEG01)与BCR-ABL阴性细胞系(HL60和U937)中RBP2的表达。结果提示RBP2在BCR-ABL阳性细胞系中表达水平明显低于BCR-ABL阴性细胞系中表达,提示RBP2与BCR-ABL存在相关性。在K562细胞、MEG01细胞和慢粒患者原代细胞中转染RBP2过表达质粒,应用Western blot和qRT-PCR的方法检测,发现在过表达RBP2后,BCR-ABL的活性形式,即磷酸化BCR-ABL(p-BCR-ABL)水平明显降低,而BCR-ABL的总蛋白水平和mRNA水平并未见明显降低,提示RBP2在转录后水平调控BCR-ABL的磷酸化水平。(3)探究RBP2调控磷酸化BCR-ABL(p-BCR-ABL)的机制在K562和MEG01细胞中转染RBP2过表达质粒后,应用qRT-PCR方法检测调控磷酸化相关分子PTEN、SHP1、PP2A、SET和PTP1B的表达水平,发现仅PTEN的mRNA表达水平明显升高。在齐鲁医院收集42例慢粒慢性期和急变期患者骨髓标本,应用qRT-PCR检测发现RBP2和PTEN的mRNA表达呈现正相关的关系。进一步在K562和MEG01细胞中转染RBP2过表达质粒,用Western blot实验检测发现PTEN的蛋白水平明显上升。在慢粒患者骨髓细胞中转染RBP2过表达质粒,应用qRT-PCR实验检测发现PTEN的mRNA水平随之上升。提取杂合型敲基因小鼠与野生型小鼠的骨髓细胞,应用qRT-PCR实验检测发现随着RBP2表达下调,PTEN的表达水平也明显降低。以上结果说明,RBP2在慢粒患者原代细胞、慢粒急变细胞系和小鼠体内均能转录调控PTEN的表达。(4)探究RBP2调控PTEN表达的机制分别将空载质粒、RBP2过表达野生型质粒和RBP2酶活性突变的过表达质粒(RBP2 H483A)转染进 K562 和 MEG01 细胞中,应用 Western blot 及 qRT-PCR检测发现野生型RBP2过表达质粒能够显著上调PTEN的mRNA和蛋白水平,而酶活性突变的过表达质粒RBP2H483A不影响PTEN表达,说明RBP2调控PTEN的表达依赖其去甲基化酶活性。在K562细胞中应用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验发现RBP2能够结合在PTEN启动子区域。随后在K562细胞中转染RBP2过表达质粒后进行ChIP实验,结果提示随着RBP2过表达,RBP2在PTEN启动子区域富集明显增加,而H3K4me2和H3K4me3在PTEN启动子区域富集明显减少。提示RBP2结合在PTEN启动子区域依赖其去甲基化酶活性。在HEK293细胞中转染RBP2过表达质粒或者RBP2 H483A质粒后,共转染PTEN启动子或者PTEN启动子结合位点突变的荧光素酶报告质粒,进行双荧光素酶活性实验。检测发现过表达RBP2后PTEN启动子活性明显升高,而RBP2 H483A对PTEN启动子活性没有明显影响,RBP2过表达质粒和RBP2H483A质粒对于结合位点突变型PTEN启动子活性均没有明显影响。以上结果说明RBP2可以调控PTEN启动子活性,且该作用依赖于其去甲基化酶活性。(5)PTEN调控磷酸化BCR-ABL(p-BCR-ABL)表达的机制研究在K562细胞中转染PTEN siRNA和MEG01细胞中转染PTEN过表达质粒,应用Westernblot及qRT-PCR实验检测,发现随着PTEN表达降低,BCR-ABL、STAT5和ERK的磷酸化水平均明显上升,而过表达PTEN后,BCR-ABL、STAT5和ERK的磷酸化水平则明显降低,BCR-ABL的mRNA表达水平并未随着PTEN的变化而改变。在K562细胞和共转染BCR-ABL与PTEN过表达质粒的HEK293细胞中,进行蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)实验,结果证实内源性和外源性的PTEN与BCR-ABL均可以相互结合。说明PTEN是通过与BCR-ABL相互结合,介导BCR-ABL去磷酸化。(6)BCR-ABL调控RBP2的表达水平分别在不同时间或不同浓度伊马替尼(IM)处理K562细胞后,进行Western blot和qRT-PCR实验,发现伴随伊马替尼(IM)处理时间的延长或者浓度的提高,RBP2的mRNA和蛋白水平呈现逐步上升的趋势,提示抑制BCR-ABL激酶活性能够诱导RBP2的表达。进一步在K562细胞中分别转染BCR-ABL siRNA或者BCR-ABL过表达质粒,然后应用Western blot及qRT-PCR方法检测RBP2及BCR-ABL的mRNA及蛋白表达水平,结果发现改变BCR-ABL的表达后,RBP2的mRNA和蛋白表达水平受到BCR-ABL的负性调控,表明BCR-ABL能够在转录水平上负性调控RBP2的表达。(7)RBP2通过BCR-ABL依赖途径调控白血病细胞增殖在K562和MEG01细胞中分别共转染RBP2过表达质粒与BCR-ABL过表达质粒、单独转染RBP2过表达质粒或者空载质粒,应用EdU和软琼脂克隆形成实验检测白血病细胞增殖的变化。结果提示过表达RBP2抑制白血病细胞增殖,而过表达BCR-ABL可以逆转RBP2过表达对于细胞增殖的抑制能力,说明RBP2抑制白血病细胞的增殖主要通过BCR-ABL通路。(二)RNA结合蛋白Lin28B通过调控miR-181d以BCR-ABL非依赖途径介导慢粒急变(1)Lin28B的表达在慢粒急变中明显上升在GEO数据库GSE4170数据集中,比较29种RNA结合蛋白在慢粒慢性期和急变期的表达差异,发现RNA结合蛋白Lin28B在慢粒急变中变化最为明显。在齐鲁医院收集的慢粒慢性期和急变期患者骨髓标本,应用qRT-PCR和免疫荧光检测发现Lin28B的mRNA和蛋白表达水平在急变期相较于慢性期都明显上升,提示Lin28B可能参与了慢粒急变的进程。(2)检测Lin28B对于慢粒急变细胞增殖的影响应用慢病毒感染K562和MEG01细胞系构建Lin28B稳定敲除的细胞系,应用EdU实验检测发现在敲除Lin28B后,白血病细胞增殖能力明显下降。(3)检测Lin28B与白血病细胞分化之间的关系分别用DMSO和PMA处理K562和MEG01细胞诱导其向巨噬细胞样和粒细胞样分化,应用Western blot和qRT-PCR检测发现白血病细胞诱导分化后,Lin28B的mRNA和蛋白表达水平明显下降,说明Lin28B参与白血病细胞分化受阻。(4)探究Lin28B调控miR-181d的机制应用慢病毒感染K562和MEG01细胞系,构建Lin28B稳定干扰细胞系,应用qRT-PCR实验检测发现随着Lin28B表达下降,miR-181d的表达水平也明显下降。提示miR-181d是Lin28B的潜在靶基因。在K562和HL60细胞中进行染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,检测发现Lin28B能够结合在miR-181d的启动子区域。然后在K562和HL60细胞中敲除Lin28B的表达,进行双荧光素酶活性实验发现Lin28B敲除后miR-181d启动子的荧光素酶活性明显降低。以上结果说明,Lin28B结合在miR-181d启动子区域激活其转录。(5)miR-181d直接调控靶基因PDCD4表达的机制在 K562 和 HL60 细胞中分别转染 miR-181d mimics 或者 miR-181d inhibitor或者相对应的对照,应用Western blot检测发现升高miR-181d的表达后,PDCD4的蛋白水平可见显著下降。反之,降低miR-181d表达后,PDCD4的蛋白水平明显上升。提示PDCD4是miR-181d的潜在靶基因。随后,构建PDCD43’UTR以及PDCD43’UTRmut(结合位点突变)双荧光素酶报告质粒。在K562和HL60细胞系中分别转染miR-181d mimics、miR-181d inhibitor或者相应的对照,共转染荧光素酶报告质粒,进行双荧光素酶报告实验提示过表达miR-181d抑制PDCD4 3’UTR荧光素酶的活性,降低miR-181d的表达则会上调PDCD4 3’UTR荧光素酶的活性,而miR-181d表达变化对结合位点突变的PDCD4 3’UTR mut荧光素酶活性并没有明显影响。以上结果说明miR-181d通过结合在PDCD4 3’UTR调控PDCD4的表达。(6)NOD-SCID小鼠体内实验证明敲除Lin28B能够抑制白血病细胞生长应用亚致死剂量的X射线辐射NOD-SCID小鼠,24小时后将1 × 1 06个Lin28B稳定敲除K562细胞以及对照K562细胞分别皮下注射在小鼠两侧腋窝,每隔3天测量一次肿瘤体积,于18天后处死小鼠,测量肿瘤重量。结果提示Lin28B敲除组小鼠肿瘤体积生长速度和重量明显小于对照组,说明在体内敲除Lin28B能够抑制白血病细胞的增殖能力。研究结论:1.发现组蛋白去甲基化酶RBP2通过结合在PTEN启动子区域激活其转录;PTEN与BCR-ABL相互结合,介导BCR-ABL去磷酸化;由此构成“RBP2/PTEN/BCR-ABL”调控轴,以BCR-ABL依赖途径介导慢粒急变。2.发现RNA结合蛋白Lin28B通过结合在miR-181d启动子区域激活其转录,miR-181d表达水平增高;miR-181d结合于PDCD4 3’UTR区域,抑制PDCD4的表达;由此构成“Lin28B/miR-181d/PDCD4”调控轴,以BCR-ABL非依赖途径介导慢粒急变。