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禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的禽大肠杆菌病为全球范围内的养禽业带来巨大的经济损失。APEC血清型众多,致病机理复杂,在一定程度上为其防治带来一定的困难。VI型分泌系统(Type VI secretion systems,T6SS)是众多致病因子中的一种,在其致病力调控方面发挥至关重要的作用。溶血素共调节蛋白(Hemolysin-coregulated protein,Hcp)是T6SS重要的效应蛋白,参与细菌的运动、细菌间竞争、黏附、动植物宿主内定殖、靶细胞内定植水平以及细菌生物膜形成等多种致病过程。但效应蛋白Hcp在APEC感染宿主免疫器官脾脏的免疫应答和抵抗机制以及与宿主细胞相互作用过程中具体所发挥的调控功能尚不清楚。本研究通过Red同源重组技术构建T6SS-2 hcp2a和hcp2b基因缺失株及回复株,并对其进行生物学特性评价;通过组织载菌量测定测定hcp2a和hcp2b基因在APEC感染雏鸡过程中对全身重要器官定植情况的影响,然后通过转录组学测序探究其在感染过程中对脾脏的免疫调控作用;此外,通过构建真核表达载体转染入DF-1细胞后对转染24 h的DF-1细胞进行转录组学测序,并以期探究效应蛋白Hcp2a和Hcp2b对DF-1细胞的具体调控机制。具体研究内容及结果如下:1.T6SS-2效应蛋白hcp基因缺失株、回复株的构建及生物学特性评价本试验以禽致病性大肠杆菌AE17菌株为野生株,利用Red同源重组技术成功构建hcp2a和hcp2b基因缺失株,利用低拷贝质粒p STV-28成功构建回复株。生长曲线测定结果表明,hcp2a和hcp2b基因对细菌生长速率并无影响;运动性试验结果显示,hcp2b基因缺失后其运动能力显著降低(P<0.01),hcp2a基因缺失对运动能力并无影响;生物膜形成能力测定结果显示,hcp2a和hcp2b基因缺失后均会使其生物膜形成能力显著增强(P<0.01);抗血清杀菌能力测定结果显示,hcp2a和hcp2b基因缺失后其抗血清杀菌能力显著降低(P<0.05);环境耐受性试验结果表明,hcp2a基因缺失导致其耐酸耐碱能力显著降低(P<0.05),抗氧化应激能力无变化,hcp2b缺失耐酸耐碱能力无显著变化,但其抗氧化应激能力较野生株显著增强(P<0.05)。2.T6SS-2效应蛋白Hcp对雏鸡脾脏转录组的影响野生株AE17、缺失株△hcp2a和△hcp2b以及回复株Chcp2a和Chcp2b分别感染雏鸡24 h后进行组织载菌量测定,结果显示,与野生株相比,缺失株△hcp2a和△hcp2b在肝、脾、肺、肾载菌量显著降低;雏鸡脾脏转录组学测序的分析结果显示,以∣log2foldchange∣≥1,P≤0.05为筛选标准,与野生株AE17相比,hcp2a基因缺失株得到512个差异表达基因,其中221个基因上调表达,291个基因下调表达;hcp2b基因缺失株得到515个差异表达基因,其中185个基因上调表达,330个基因下调表达。通过荧光定量PCR对随机筛选的差异表达基因进行了验证,与测序结果一致,说明测序结果可靠。KEGG分析结果显示,△hcp2a的差异表达基因主要富集在细胞因子与细胞因子受体的相互作用、细胞粘附分子(CAMs)及ECM-受体相互作用等通路;△hcp2b的差异表达基因主要富集在内质网中的蛋白质加工、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、细胞粘附分子(CAMs)及MAPK信号通路等通路。3.T6SS-2效应蛋白Hcp对DF-1细胞骨架稳定性的影响重组真核表达载体p EGFP-N1-Hcp2a、p EGFP-N1-Hcp2b转染入DF-1细胞内24h、48 h以及72 h后观察荧光,结果发现,效应蛋白Hcp2a和Hcp2b转染DF-1细胞后出现明显荧光颗粒聚集现象。对蛋白Hcp2a和Hcp2b转染的DF-1细胞进行转录组学测序发现,Hcp2a有46个差异表达基因,Hcp2b有59个差异表达基因,通过荧光定量PCR对随机筛选的差异表达基因进行了验证,与测序结果一致,说明测序结果可靠。KEGG分析结果显示,Hcp2a的差异表达基因主要富集在细胞因子与细胞因子受体相互作用和Toll样受体信号通路等免疫相关通路,Hcp2b的差异表达基因主要富集在胞吞作用、磷脂酰肌醇信号系统及钙信号通路等通路。此外与细胞骨架有关的TPM4基因表达水平在蛋白Hcp2a和Hcp2b过表达的DF-1细胞内均出现大幅度降低,试验结果表明,效应蛋白Hcp2a和Hcp2b在DF-1细胞表达后导致细胞骨架的稳定性下降。综上所述,本试验成功构建T6SS-2效应蛋白hcp2a和hcp2b基因缺失株和回复株,hcp2a和hcp2b基因影响其生物学特性;T6SS-2效应蛋白hcp2a和hcp2b基因缺失影响APEC在体内肝、脾、肺、肾组织器官的定植能力,且主要通过调节细胞因子与细胞因子受体的相互作用、细胞粘附分子(CAMs)等免疫相关通路的调控进而影响其对宿主的致病机制;效应蛋白Hcp2a和Hcp2b在DF-1细胞内通过调节TPM4的表达进而影响细胞骨架的稳定性。