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家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组全长128kb,预测编码136个ORF,BmNPV ORF97和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)ORF119(Ac119)为同源基因,已有研究表明Ac119是一个重要的口服感染因子,命名为pif-1。研究表明AcMNPV缺失了pif-1时,其包涵体来源病毒(ODV)就会失去口服感染性,但却不影响芽生病毒粒子(BV)的感染性。而BmNPV ORF97(pif-1)的功能尚没有研究。 因此,本论文主要从BmNPV pif-15-RACE序列分析、启动子序列分析、抗体制备、pif-1基因的表达时相分析以及蛋白的细胞定位这几方面来开展相关研究,为后期pif-1的深入研究奠定基础。 1)pif-1序列分析:通过5-RACE技术,克隆得到了BmNPV pif-1的5上游序列(100bp左右),在5上游序列可以看到病毒晚期启动子的保守序列(A/T/G)TAAG。进一步对PIF-1编码序列分析发现其含有2个RGD基序。KSHV(加上全名)研究表明 RGD基序可以介导目的蛋白与整联蛋白αVβ3结合,促使病毒粒子与靶细胞的融合。 2)PIF-1抗体制备:运用了原核表达系统成功表达了PIF-1蛋白。通过免疫新西兰大白兔成功的得到了特异比较高的抗体,为后期蛋白互作及蛋白定位研究奠定基础。 3)pif-1的转录时相分析:通过荧光定量PCR技术得到了pif-1的转录时相。在病毒的感染早期,主要是利用宿主的一些细胞元件和原料来合成自身的蛋白,在晚期病毒粒子的组装过程中一些功能性的蛋白开始大量的表达,以利于病毒的组装和传播。 4)pif-1亚细胞定位分析:利用瞬时表达系统,将pif-1与eGFP融合表达,通过激光共聚焦显微镜观察荧光分布位置,结果发现pif-1-eGFP荧光均匀分布于细胞质中,而在病毒感染后,荧光进入细胞核中,表明pif-1在其它病毒因子参与下,被运输至细胞核中,并在其中被装配到核衣壳中,形成成熟的ODV粒子。 通过以上的研究和分析,我们预测 PIF-1蛋白在口服感染的过程中可能介导口服感染复合物与整联蛋白αVβ3互作,使得ODV粒子与中肠上皮细胞相结合,从而完成ODV粒子与上皮细胞的膜融合。