研究背景：　　脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是指由于外界直接或间接因素导致脊髓损害，在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍，肌张力异常及病理反射等相应改变。脊髓损伤包括原发性和继发性损伤。原发性神经元死亡是发生在损伤瞬间的力学损伤，是临床上无法控制和治疗的损伤。神经元继发性死亡主要原因是缺血缺氧、神经兴奋性毒性、氧化应激和炎症反应等。神经元继发性死亡方式为坏死（necrosis）、凋亡（apoptosis），最近发现自噬（autophagy）也在脊髓继发性损伤中发挥一定作用。　　自噬是在营养缺乏或氧化应激时，细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子的过程。线粒体是细胞内重要的细胞器，通过氧化磷酸化提供ATP同时与很多新陈代谢的功能相关。线粒体功能的紊乱与很多神经退行性疾病相关，例如重症肌无力和帕金森病。线粒体自噬是一种特殊的自噬，能够选择性的清除受损的线粒体。最近文献报道线粒体自噬在中枢神经系统疾病中扮演至关重要的角色。尽管大多数文献报道线粒体自噬能够清除受损的线粒体从而发挥一定的保护作用，但也有文献报道增加的线粒体自噬导致了浦肯野细胞的死亡。之前，我们已经在脊髓损伤中发现了线粒体自噬。　　BNIP3和其同源体NIX，是BH3蛋白，定位于线粒体上，已经证实在缺氧以及红细胞成熟的过程中诱导线粒体自噬，BNIP3诱导的线粒体自噬能够对抗其介导的细胞死亡。尽管之前我们已经在脊髓损伤中发现了BNIP3、NIX表达增高。BNIP3以及NIX与LC3相互作用诱导线粒体自噬也在其他细胞类型中得到证实。但是BNIP3与NIX在脊髓损伤中介导的线粒体自噬中的机制及作用仍然未知。　　因此，本文将检测缺氧神经元的超微结构以及线粒体自噬相关蛋白在线粒体中的表达变化；检测BNIP3、NIX与LC3的相互作用以及线粒体-BNIP3-LC3-自噬体膜复合结构体的形成；抑制BNIP3、NIX对线粒体自噬的影响以及缺氧脊髓神经元的作用；阐明线粒体自噬在脊髓损伤中的机制及作用。　　目的：　　研究大鼠脊髓神经元缺氧后线粒体自噬的表达，缺氧相关蛋白HIF-1α、p53在大鼠脊髓神经元以及线粒体自噬相关蛋白BNIP3、NIX在大鼠脊髓神经元线粒体中缺氧不同时间点的表达变化及意义，观测线粒体-BNIP3-LC3-自噬体膜复合结构体的形成，探讨线粒体膜结合的BNIP3与自噬体膜复合结构体上LC3的相互作用，抑制HIF-1α和（或） p53对BNIP3、NIX、BAX表达的影响，抑制BNIP3、NIX后对脊髓神经元缺氧后的作用。本研究为线粒体自噬确定新的信号通路，为脊髓损伤神经元提供潜在的保护方式。　　方法：　　原代培养的大鼠脊髓神经元缺氧 24 小时后，透射电镜检测其超微结构；免疫印迹检测缺氧0h、6h、12h、24h、36h、48h后，HIF-1α、p53、BNIP3、NIX、BAX在脊髓神经元以及缺氧0h、6h、24h、48h后，LC3、BNIP3、NIX在脊髓神经元线粒体的表达变化；神经元感染 GFP-LC3腺病毒，缺氧24小时后，免疫荧光检测 BNIP3及自噬的表达。　　原代培养的大鼠脊髓神经元，共感染RFP-BNIP3过表达（或NIX过表达）及GFP-LC3腺病毒，透射电镜检测其超微结构；免疫荧光检测线粒体-BNIP3-LC3-自噬体膜复合结构体的形成；免疫共沉淀检测BNIP3、NIX与LC3的相互作用；CCK-8分析各组的细胞活力。　　原代培养的大鼠脊髓神经元，感染HIF-1αshRNA和（或p53shRNA）腺病毒，缺氧24小时后，免疫印迹检测HIF-1α、p53、BNIP3、NIX、BAX的表达变化。原代培养的大鼠脊髓神经元，感染BNIP3shRNA（或NIX shRNA）腺病毒，缺氧24小时后，免疫荧光检测线粒体的完整性；免疫印迹检测BNIP3、NIX、LC3及TOM20的表达变化；CCK-8分析各组的细胞活力。　　实验结果采用 GraphPad Prism6软件进行显著性检验和相关性分析，实验数据以均数±标准差（(x) ±s）表示，采用单因素方差分析，p＜0.05 表示有统计学差异。　　结果：　　1.脊髓神经元缺氧24小时后观测到神经元线粒体肿胀、空泡的形成，高倍镜下检测到双层膜的神经元线粒体自噬体；Western blot检测发现在神经元缺氧24小时后 HIF-1α、p53明显升高（P＜0.05），BNIP3在12小时后明显升高（P＜0.01），NIX在36小时后明显升高（P＜0.01），而BAX的表达无明显变化。BNIP3、NIX及LC3-II/ LC3 I的水平在缺氧 24 小时后的神经元线粒体中明显升高（P＜0.01）；线粒体标志物 TOM20随缺氧时间推移逐渐减弱；免疫荧光检测缺氧24小时后，BNIP3及点状绿色荧光自噬体的共表达。　　2. BNIP3过表达神经元中透射电镜发现更多的线粒体自噬小体；免疫荧光检测到线粒体-BNIP3-LC3-自噬体膜复合结构体的形成；免疫共沉淀检测到BNIP3、NIX与LC3的相互作用；CCK-8显示过表达BNIP3的神经元在感染24小时后，细胞活力明显下降（P＜0.01），而过表达NIX的细胞活力较常氧组无明显差异（P＞0.05）。　　3.通过RNA干扰抑制HIF-1α能减弱BNIP3和NIX的表达（P＜0.01），抑制p53能减弱NIX的表达（P＜0.01），而同时抑制HIF-1α和p53几乎完全封闭BNIP3、NIX的表达（P＜0.01）；免疫荧光显示抑制BNIP3明显保护了缺氧神经元线粒体的完整性，而抑制NIX较缺氧组无明显差异；Western blot检测发现抑制BNIP3减弱LC3-II/ LC3 I的表达水平（P＜0.01），增加TOM20的表达量（P＜0.05），而抑制NIX虽然也减弱LC3-II/ LC3 I的表达水平（P＜0.05），但TOM20的表达量无明显变化（P＞0.05）；CCK-8显示抑制BNIP3的神经元在感染24小时后，细胞活力明显增高（P＜0.01），而抑制NIX的细胞活力较缺氧组无明显差异（P＞0.05）。　　结论：　　1.大鼠脊髓神经元缺氧后神经元线粒体自噬被诱导激活。　　2.线粒体自噬相关蛋白BNIP3诱导缺氧神经元线粒体自噬。　　3.通过RNA干扰抑制BNIP3的表达保护了缺氧引起的神经元死亡。