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[目 的]獐牙菜属(Swertia)植物作为中草药已经有上千年的历史,在世界各地广泛被用于治疗感染、发热、疟疾、肝病、肝炎、胃炎、寄生虫、癫痫、尿少、高血压、黄疸、糖尿病等多种疾病。青叶胆(S.mileensis)原植物为弥勒獐牙菜(S.mileensis),为云南特有的传统中药,具有保肝、抗菌、降血糖、抗胆碱以及解痉等多种药理活性,尤其对病毒性肝炎疗效显著;而肝炎病毒感染是肝细胞癌(HCC)的主要病因之一。同时,青叶胆所属的龙胆科(Gentianaceae)獐牙菜属同属的多种植物已经有抗肿瘤方面的研究报道。因此,我们假设青叶胆中提取的咧环烯醚萜(Secoiridoid)类成分獐牙菜苦苷(Swertiamarin/STM)对肝细胞癌具有抑制作用,在本课题中探索:①青叶胆是否对人肝细胞癌(HCC)具有治疗作用;②青叶胆提取物獐牙菜苦苷是否具有抑制人肝癌细胞的作用;③獐牙菜苦苷对人肝癌细胞作用的具体机制。[方法]1体外细胞表型检测及IC50筛选提取自青叶胆(S.mileensis)植物全株的獐牙菜苦苷(Swertiamarin/STM)作用于三株人肝癌细胞HepG2,Huh7及SK-Hep-1及一株人正常细胞HL-7702,检测细胞增殖、侵袭及凋亡的变化并确定IC50作用浓度;2 mRNA基因芯片检测及生物信息学分析对獐牙菜苦苷(STM)干预HepG2细胞进行mRNA基因芯片检测,并对检测结果进行多数据库信息学分析,预测獐牙菜苦苷(STM)对人肝癌细胞作用的具体细胞信号传导机制;3细胞信号传导机制验证(1)獐牙菜苦苷(STM)干预后HepG2内细胞因子变化:应用Q-PCR及蛋白质印迹(western blot)分别从基因及蛋白水平验证獐牙菜苦苷(STM)能否在人肝癌细胞HepG2中影响CDKN1A(P21)、TNF-α及AKT的表达,以及对这三个因子的调控趋势是上调还是下调;并且应用免疫荧光检测更加直观的显示獐牙菜苦苷(STM)在人肝癌细胞HepG2中对CDKN1A(P21)的影响;(2)干扰DKN1A(P21)表达试验:应用CCK8、流式细胞仪、Q-PCR及蛋白质印迹(western blot)检测在CDKN1A(P21)表达被干扰的情况下獐牙菜苦苷(STM)干预后的HepG2细胞增殖、凋亡的变化,以及HepG2细胞内CDKN1A(P21)、AKT及TNF-α表达的变化;(3)过表达CDKN1A(P21)实验:应用CCK8、流式细胞仪、Q-PCR及蛋白质印迹(western blot)以检测提高CDKN1A(P21)表达对獐牙菜苦苷(STM)抗癌能力的影响及对AKT及TNF-α的调控的影响;(4)体内实验:獐牙菜苦苷(STM)对裸鼠皮下SK-Hep-1种植瘤模型进行瘤内注射,并对种植瘤进行体积及重量对比、Q-PCR及免疫荧光染色以明确体内层面獐牙菜苦苷(STM)对种植瘤细胞内CDKN1A(P21)、AKT及TNF-α的影响。[结果]1体外细胞表型检测及IC50筛选首先计算出獐牙菜苦苷(STM)对HepG2的IC50抑制浓度为87.57μg/ml;对huh7的IC50抑制浓度为63.035μg/ml;对SK-HEP1的IC50抑制浓度为55.302μg/ml;按此浓度作用于HepG2、huh7、SK-HEP1细胞后獐牙菜苦苷(STM)能明显抑制 HepG2、huh7、SK-HEP1 的增殖、侵袭,促进 HepG2、huh7、SK-HEP1的凋亡,说明獐牙菜苦苷(STM)对人肝癌细胞具有明显的抑制效果;2 mRNA基因芯片检测及生物信息学分析选取对獐牙菜苦苷(STM)干预后的HepG2细胞进行了 mRNA基因芯片检测,在检测出的33655个mRNA中发现与对照组相比共有3563个差异基因。应用多个数据库对芯片结果进行多方面信息分析后我们预测青叶胆(S.mileensis)提取物獐牙菜苦苷(STM)至少部分是通过影响CDKN1A(P21)的表达参与PI3K-AKT通路及TNF-α通路的调控,从而起到抑制人肝癌细胞增殖、侵袭,促进人肝癌细胞凋亡的作用;3细胞信号传导机制验证(1)Q-PCR及蛋白质印迹(western blot)及免疫荧光检测结果:①獐牙菜苦苷(STM)干预后与对照组相比HepG2内CDKN1A(P21)、TNF-α表达明显升高,AKT表达明显降低;②獐牙菜苦苷(STM)干预后HepG2细胞中AKT蛋白量降低而TNF-α蛋白量升高;③免疫荧光检测发现在对照组中CDKN1A(P21)荧光染色强度在三株人肝癌细胞内均比正常肝细胞低;与对照组相比实验组四株细胞内的CDKN1A(P21)荧光染色强度均有增强,尤其在三种肝癌细胞实验组的CDKN1A(P21)增强更加明显;(2)siDKN1A(P21)试验①细胞增殖:对照组HepG2在不受干扰时细胞增殖率最高;HepG2+STM组的细胞增殖受到了明显抑制而在加入siNC后HepG2+STM+siNC中的细胞增殖仍然受到明显抑制;HepG2+STM在加入siP21后獐牙菜苦苷(STM)对HepG2增殖的抑制作用明显降低;②细胞凋亡:对照组HepG2在不受干扰时细胞凋亡率最高;HepG2+STM组的细胞凋亡明显增加,而在加入siNC后HepG2+STM+siNC中的细胞凋亡仍然明显,其增加比率与HepG2+STM组相当;HepG2+STM+siP21组中HepG2凋亡率最低;③Q-PCR:CDKN1A(P21)表达升高伴随着AKT表达的降低及TNF-α表达的升高,而CDKN1 A(P21)表达的降低则伴随着AKT表达的升高及TNF-α表达的降低;④western blot:獐牙菜苦苷(STM)的干预会引起HepG2细胞中DKN1A(P21)及TNF-α蛋白水平增加,AKT蛋白水平降低;加入si-NC后獐牙(?)苦苷(STM)对HepG2细胞内CDKN1A(P21)、AKT及TNF-α蛋白水平的作用没有明显变化;DKN1A(P21)的蛋白复制被干扰后TNF-α的蛋白水平随之降低,而AKT的蛋白水平随之升高;(3)过表达CDKN1A(P21)实验①过表达CDKN1 A(P21)后HepG2细胞增殖降低;②过表达CDKN1A(P21)后HepG2细胞凋亡明显增加;③Q-PCR:过表达CDKN1A(P21)后HepG2细胞内CDKN1A(P21)明显上调,随之AKT下调,而TNF-α上调;④western blot:过表达CDKN1 A(P21)后HepG2细胞内CDKN1A(P21)蛋白水平明显升高,随之AKT蛋白明显减少,而TNF-α蛋白明显升高。(4)体内实验①獐牙(?)苦苷(STM)瘤内注射后裸鼠种植瘤生长明显受到抑制,成瘤速度、体积及重量均明显低于对照组;②Q-PCR:种植瘤内CDKN1A(P21)及TNF-α的表达随着獐牙菜苦苷(STM)的干预而增加,而AKT的表达随着獐牙菜苦苷(STM)的干预而减少;③免疫荧光染色:实验组代表CDKN1A(P21)的绿色荧光较对照组明显增多;实验组代表AKT的红色荧光较对照组明显减少;实验组中代表TNF-α的青色荧光较对照组明显增多;对照组的混合荧光显像以代表AKT的红色荧光为主,而在实验组中混合荧光显像以代表CDKN1A(P21)及TNF-α的绿色及青色荧光为主。[结 论]青叶胆(S.mileensis)对人肝细胞癌(HCC)具有治疗作用,其抑癌作用至少部分是通过植株内主要成分之一的獐牙菜苦苷(STM)来实现;獐牙(?)苦苷(STM)至少部分具体的抑癌机制为调控CDKN1A(P21)参与PI3K-AKT通路及TNF-α通路,从而抑制人肝癌细胞增殖、侵袭,促进人肝癌细胞的凋亡。