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研究目的1.观察抑制自噬对高脂饮食诱导的肥胖大鼠骨骼肌的影响;2.探讨自噬对棕榈酸诱导的C2C12肌管萎缩的作用及机制;3.探讨棕榈酸诱导的C2C12肌管和db/db肥胖小鼠骨骼肌中,P300对自噬的调控作用以及对肌纤维重塑的影响。研究方法1.SD雄性大鼠随机分为正常组(Control)、高脂组(HFD)、高脂+氯喹组(HFD+CQ)。用高脂饮食连续喂养大鼠16周建立肥胖模型。随后,HFD+CQ组接受自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ,50mg/kg/d)腹腔注射给药2周,同时,Control组和HFD组接受等量生理盐水注射。通过(1)油红染色显示肌纤维中脂质沉积情况;(2)Western Blot(WB)和免疫荧光法检测自噬相关蛋白(LC3、p62)的表达;(3)电子抓力仪测定大鼠前肢的最大抓力,分离腓肠肌并用分析天平称取湿重;(4)苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,并测定肌纤维横截面面积(cross-sectional area,CSA);(5)WB检测肌萎缩基因Atrogin-1的蛋白质表达水平。2.(1)体外培养C2C12小鼠成肌细胞,干预前诱导其分化为肌管。用棕榈酸(palmitic acid,PA)刺激C2C12肌管,随后通过(1)WB、RT-qPCR、免疫荧光检测肌管萎缩相关分子标志物表达水平,包括肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、肌萎缩基因(Atrogin-1、MuRF1),光镜下观察并测定肌管直径;(2)采用WB、透射电镜、mRFP-GFP-LC3荧光慢病毒感染评估细胞内自噬流的变化情况;(3)将自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,2 mM)添加到PA处理的C2C12肌管,采用WB检测自噬相关蛋白(LC3、p62)的表达,以评估PA对自噬小体合成的影响。(2)用自噬抑制剂氯喹(CQ,1μM)和自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA,50 nM)分别与PA(0.4mM)共刺激肌管36h,(1)通过WB、MDC免疫荧光染色法验证CQ和RAPA对自噬的影响;(2)采用WB、RT-qPCR检测肌管萎缩相关分子标志物(MHC、Atrogin-1、MuRF1)的变化情况,同时光镜下观察并测定肌管直径,以评估自噬在PA诱导的肌管萎缩中的作用。3.(1)用棕榈酸(PA)刺激已分化的肌管,利用Western Blot检测P300相关蛋白的表达水平:P300、磷酸化P300(phosphorylated p300,P-P300)、乙酰化组蛋白H3(acetylated histone H3,Ac-H3)。(2)采用P300特异性抑制剂c646干预PA刺激的肌管,通过(1)WB检测Ac-H3(P300重要的底物)表达水平,以验证c646对P300的抑制效能;(2)WB、RT-qPCR检测肌管萎缩相关分子标志物表达水平;(3)WB、免疫荧光法、mRFP-GFP-LC3荧光慢病毒感染评估细胞内自噬流的情况。(3)用自噬抑制剂CQ与c646、PA共处理肌管,(1)WB检测自噬相关蛋白(LC3、p62)的表达,以验证CQ对自噬流的抑制作用;(2)WB、RT-qPCR检测肌管萎缩相关分子标志物的变化情况,并测定肌管直径,以评估自噬是否介导了P300在PA诱导的肌管萎缩中的作用。(4)雄性db/db肥胖小鼠随机分为db/db组,db/db+c646组,遗传背景相同的m/m小鼠分为m/m组,m/m+c646组。m/m+c646组和db/db+c646组接受c646(30 nmol/g/d)腹腔注射给药,连续2周,同时正常m/m组和db/db组接受等量c646溶剂注射。(1)油红染色显示肌纤维中脂质沉积情况;(2)WB、免疫组化检测P300相关蛋白的表达情况;(3)WB、组织免疫荧光法检测自噬相关蛋白(LC3、p62)的水平;(4)电子抓力仪测定小鼠前肢的最大抓力,分离腓肠肌并用分析天平称取湿重;(5)HE染色后测定肌纤维横截面面积;(6)RT-qPCR检测肌萎缩基因(Atrogin-1、MuRF1)的转录水平。研究结果1.在高脂饮食构建的肥胖大鼠模型骨骼肌中,存在着明显的脂质异位沉积。同时,LC3-II/I、p62的蛋白水平升高,提示自噬流受阻。此外,肥胖大鼠的肌肉质量、力量和纤维大小均较正常饮食对照组出现明显降低并伴随着肌萎缩基因Atrogin-1的高表达;利用自噬抑制剂CQ干预,加重了高脂诱导的自噬流受损(LC3-II/I、p62蛋白水平进一步升高)和上述肌萎缩相关指标的变化。2.(1)PA以时间和浓度依赖地方式抑制了肌管细胞内肌球蛋白MHC的表达,同时过度激活了肌萎缩基因(Atrogin-1、MuRF1)转录,并导致了肌管直径减小。此外,PA还抑制了自噬流的水平(表现为自噬小体和溶酶体融合受阻,自噬小体堆积以及自噬蛋白LC3-II/I、p62水平升高)。(2)利用自噬激活剂RAPA激活自噬可以一定程度地逆转PA诱导的MHC蛋白降解、肌萎缩基因激活以及肌管直径减小;而通过CQ抑制自噬则结果相反。3.(1)在PA刺激的肌管中,P-P300和Ac-H3的蛋白水平明显升高,说明PA组的P300活性被诱导上调。通过药理特异性抑制P300激活,可显著降低LC3-II/I、p62的蛋白浓度,促进自噬小体和溶酶体融合,并减少自噬小体堆积。抑制P300同时还一定程度地逆转了PA诱导的MHC蛋白降解、肌萎缩基因激活以及肌管萎缩。但通过CQ阻断自噬,抑制P300在PA诱导的肌管萎缩中的作用被明显阻断。(2)在db/db肥胖小鼠腓肠肌中,高脂诱导了P300磷酸化增强了其活性,同时,高脂还导致了自噬流受阻(LC3-II/I、p62蛋白浓度增加)。通过c646选择性抑制P300激活可下调db/db鼠肌肉的自噬蛋白(LC3-II/I和p62)表达水平,抑制肌萎缩基因激活,并一定程度地改善了小鼠的抓力和肌纤维萎缩。研究结论高脂可以通过激活P300抑制肌肉内自噬流,并最终诱导肌萎缩相关标志物的异常表达和肌纤维重塑。抑制P300活性或激活自噬流可能是改善高脂性肌萎缩的有效手段。