研究背景随着生活水平的提高和饮食结构的变化，人们患有心血管疾病的风险越来越大。许多情况下，病人需要通过血管的置换手术来提高生活质量甚至是挽救生命。患者自身其它部位的血管被认为是置换手术中的最好的材料，但大多数患者并不具备合适的可移植血管，尤其是实施多次手术的患者；另外这个手术的实施极易对患者会造成新的创伤。于是人们便开始寻找新型的血管替代材料，组织工程概念的提出为构建组织工程血管提供了理论依据和实验方法。制备脱细胞的异种血管支架是目前组织工程血管研究领域的一个热点。同其它类型的组织工程血管相比，脱细胞异种血管支架具备更多优点。与合成材料为基质的组织工程血管相比，脱细胞异种血管支架具备更好的力学特征和生物相容性；与由胞外基质蛋白(胶原蛋白或弹性蛋白)交联而成的支架相比，它具备更好的三维结构，更高的力学强度；同细胞自组装的组织工程血管相比，它的制备更加简单，同时制备的周期更短。脱细胞血管支架比起其它类型的组织工程血管具备很多优点，而且在许多动物试验中也得到证实。但有很多实验结果表明，动物的在体细胞募集能力比人类强很多，即使是生物相容性较差的合成材料植入动物体内也能获得较好的细胞化，因此，脱细胞支架在人体内能否取得同样的效果还需要更多的临床实验结果来证明。事实上，脱细胞异种血管(或瓣膜)在人体内的实验结果却并不理想，主要原因是炎症反应、钙化以及支架材料的降解引起的并发症。因此，脱细胞异种血管支架在人体内的得到广泛应用之前，还有许多问题需要得到解决。首先，如何控制脱细胞血管支架在体内的降解速度?通过对血管支架的胶原纤维进行交联处理，不仅可以减缓材料的降解过程，为组织的重建提供更充裕的时间，还可以有效降低免疫原性和钙化的发生。其次，如何实现脱细胞异种血管的体外再细胞化?有充分的证据表明，血管内皮细胞(EC)能够有效防止血栓形成以及血管再狭窄所引起的血管阻塞，进而提高组织工程血管移植的成功率。但作为血管的另一个重要细胞成分平滑肌细胞(SMC)的体外再细胞化研究却很少，而两种细胞成分在组织工程血管上的联合细胞化的研究更是屈指可数。SMC和EC之间的相互作用达到某种平衡被认为是维持血管正常功能所必须的，用于研究SMC和EC之间相互关系的研究模型，不论是两种细胞在PET膜两侧的共培养，或者在培养瓶中直接将EC种植于SMC细胞层上，都能证明SMC和EC之间能够相互影响，这种影响不仅可以发生在形态学水平，还发生在分子生物学水平。因此，对脱细胞异种血管支架进行SMC和EC的联合种植，将有利于使两种细胞的增殖、分化和功能更接近于在体环境，提高组织工程血管移植的成功率。本研究中，我们对犬主动脉进行一系列脱细胞处理，并对制备出的脱细胞血管支架进行综合评价，最后将在体外实现脱细胞血管支架的再细胞化，包括SMC和EC在支架材料上的单独种植，以及EC在SMC上的联合种植，拟制备出结构和功能更加完整的组织工程血管支架。具体方法如下：研究方法1．犬动脉的脱细胞处理我们实验室的前期研究结果表明，应用多聚环氧化合物EX-810来处理主动脉，除了能够有效地交联支架的胶原纤维外，还能部分去除支架内的细胞成分，同时保持胞外基质的结构的完整，而且表现出极小的细胞毒性。但是，EX-810的主要作用是引起细胞的破裂，而残留的细胞碎片可能会导致钙化的发生。因此我们加入了低盐渗透和超声的方法，加速细胞的破碎，同时更有效去除细胞残片。试验中应用HE染色，DAPI染色技术来检测脱细胞的效果。2．脱细胞犬动脉力学性能的评价除了上述对脱细胞犬动脉进行脱细胞效果检测外，支架的力学性能评价也是判断一种组织工程血管优劣所必须的。力学性能的检测应用INSTRON8874生物力学测试系统(Instron Co．，USA)行单轴拉伸试验，测定脱细胞犬动脉支架的各种力学指标，包括血管的最大荷载、最大荷载时的能量，最大荷载的伸长长度，以及最大荷载时的应变率。3．脱细胞犬动脉的生物相容性检测及体外再细胞化研究通过不同密度的SMC和EC在脱细胞犬动脉支架表面的种植，以及EC在不同密度的SMC表面的种植。一方面对支架材料的细胞相容性进行评价，另一方面确定在材料表面实现快速细胞化所需要的细胞种植密度，以及如何实现EC和SMC在组织工程血管支架表面的直接联合培养。用于主要的研究方法有扫描电镜(SEM)、噻唑蓝(MTT)和免疫组化染色。应用Image-Pro Plus图像处理软件对SEM图片进行分析，计算细胞覆盖率。4．体外再细胞化的脱细胞犬动脉抵抗流体切应力的研究由于以合成材料为基质的大口径血管支架已经在临床上得到成功应用，本研究主要针对于小口径组织工程血管的制备。因此为了检验种子细胞在支架材料表面的粘附力，我们对细胞化的以脱细胞犬动脉为基质的组织工程血管支架施加5dyn/cm~2的流体切应力，作用时间分别为2h和4h，通过SEM来观察细胞的粘附能力；同时利用Image-Pro Plus图像处理软件对SEM图片进行分析，计算细胞覆盖率，确定流体切应力作用前后细胞在组织工程血管支架表面的覆盖率变化情况。结果1．HE染色和DAPI染色法均表明，EX-810能够有效降低犬动脉内的细胞成分，但脱细胞的效果并不彻底。去离子水和超声在某种程度上能够提高EX-810的脱细胞效果。三者共同作用下，几乎所有的细胞成分都能除去，同时胞外基质的三维结构保持完整。2．经过EX-810、去离子水和超声处理的脱细胞犬动脉，各种力学指标的差异均无显著差异，说明脱细胞处理并没有改变犬动脉的力学性能。3．种子细胞(SMC和EC)在以脱细胞犬动脉为基质的组织工程血管支架表面生长良好。随着接种密度的提高，种子细胞在材料上的排布更加有序；提高接种的密度有利于在材料表面快速形成致密的细胞层。高密度接种EC能够在不同接种密度的SMC上获得致密的内皮细胞层，但内皮细胞的形态、内皮细胞的覆盖率与SMC的接种密度有关。随着底层SMC接种密度的增加，EC由典型的铺路石状变为长梭形，细胞的立体感加强；在中等SMC接种密度条件下，EC在SMC上的覆盖率最高。4．对再细胞化的以脱细胞犬动脉为基质的组织工程血管支架施加5dyn/cm~2切应力(2h和4h)，不论是EC单独种植模型，还是EC在不同密度SMC上的种植模型，致密的内皮细胞层没有被破坏，说明我们制备以脱细胞犬动脉为基质的组织工程血管支架移植入体内后，种植的EC仍然能够发挥正常的生理功能。结论1．应用EX-810、超声和去离子水共同作用于犬动脉，能够有效去除血管内的细胞成分，大大降低免疫原性。2．以上脱细胞的方法能够有效保持血管本身的力学性能。3．制备出的以脱细胞犬动脉为基质的组织工程血管支架具有良好的细胞相容性，能够在体外实现SMC和EC单独种植，以及EC在SMC上复合种植，并最终获得致密的内皮细胞层。4．体外再细胞化的以脱细胞犬动脉为基质的组织工程血管在5dyn/cm~2切应力作用下能够保持内皮细胞层的完整。