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随着经济社会的发展,心血管疾病在世界范围内给人类带来了巨大的健康和经济负担,具有很高的死亡率和发病率。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是最常见的血管病变之一,也是心血管疾病的主要病理基础,其特征是复杂的动脉粥样硬化斑块的形成,导致动脉硬化和狭窄,临床上表现为冠心病、外周动脉疾病及缺血性中风等。不稳定的动脉粥样硬化斑块破裂、血小板聚集、血栓形成引起的狭窄或血管闭塞可导致严重的急性心血管疾病,对人类健康造成极大的威胁。因此,探索针对动脉粥样硬化的靶向治疗方法显得尤为迫切。在动脉粥样硬化的发病过程中,许多细胞和分子参与了它的病理和病理生理过程,主要包括内皮细胞、平滑肌细胞和炎症细胞。目前关于动脉粥样硬化发病机制的学说主要有三种,即脂质渗入学说、内皮损伤学说、血管平滑肌细胞迁移与增殖学说。其中,内皮损伤学说认为动脉粥样硬化斑块是动脉内皮损伤的产物,AS的病理生理来源于内皮细胞损伤,随后越来越多的研究指出内皮细胞的功能障碍是早期动脉粥样硬化的一个标志。因而改善内皮细胞的功能对动脉粥样硬化的治疗具有十分重要的意义。环状RNA(CircRNAs)是一类新的内源性非编码RNA(NcRNA),它不具有5’帽子和3’poly(A)尾巴,以其特征性的共价闭环状形式存在。越来越多的研究表明,CircRNAs在体内广泛存在,在血浆、血清及组织中稳定表达,参与了真核生物基因表达的调控。已有的研究发现多个环状RNA参与了多种心血管疾病的发生发展过程。circRNA-CER是一种新发现的环状RNA,研究它可以通过充当MiR-136“海绵”调节人软骨降解中MMP13的表达,但对于它在心血管疾病的功能还尚不清楚。因此在本研究中,我们探究了circRNA-CER在调控内皮细胞功能中的作用,并进一步地对其发挥调控作用地具体机制进行了研究。第一部分:circRNA-CER过表达对ox-LDL诱导后内皮细胞增殖、凋亡等生物学行为影响目的:体外模拟动脉粥样硬化的发病机制,在该模型中过表达circRNA-CER观察对内皮细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响。方法:用不同浓度的ox-LDL处理内皮细胞不同的时间,通过RT-PCR方法检测circRNA-CER的表达,从而明确ox-LDL的最佳干预浓度及时间。用ox-LDL处理人脐静脉内皮细胞建立损伤模型,模拟动脉粥样硬化的发病机制,对干预后的细胞转染过表达circRNA-CER的质粒,通过CCK8实验及EdU实验检测circRNA-CER高表达对ox-LDL干预后的脐静脉内皮细胞增殖能力的影响,再通过流式细胞分析方法检测对细胞凋亡的影响。并进一步地通过划痕实验、transwell实验、成管实验评价circRNA-CER高表达对细胞迁移、侵袭及血管生成的影响。结果:ox-LDL用于后续实验的最佳干预条件为:干预浓度100mg/L,干预时间为24h。环状RNA circRNA-CER的过表达促进了细胞增殖、迁移、侵袭及血管生成的作用,同时对细胞凋亡具有抑制作用。结论:明确了circRNA-CER在调控内皮细胞生物学行为中的作用,为进一步研究奠定了基础。第二部分:CircRNA-CER通过miR-136/MMP13轴调控VEGF表达目的:探索circRNA-CER在调控内皮细胞生物学行为的具体机制。方法:通过western blot及RT-PCR方法检测circRNA-CER沉默或过表达后对miR-136、MMP13、VEGF表达量的影响。进一步地在过表达circRNA-CER的基础上联合miR-136的激动剂及抑制剂、MMP13 siRNA观察对蛋白表达的影响。通过荧光素酶报告实验观察circRNA-CER、miR-136、MMP13之间的相互作用关系。结果:circRNA-CER沉默后miR-136的表达量显著升高,MMP13的表达量明显减少,而在沉默circRNA-CER的同时,联合使用miR-136的抑制剂,则能逆转circ-CER的沉默对MMP13表达的抑制作用。circRNA-CER的过表达会引起miR-136的表达量显著减少,而MMP13的表达量明显增加,当同时联合miR-163 mimic时则能逆转circRNA-CER过表达导致的MMP13的增加。circRNA-CER的过表达会导致VEGF表达量的增加,而联合miR-136 mimic或MMP13siRNA则会逆转circRNA-CER过表达引起的VEGF增加。荧光素酶基因报告实验说明了circRNA-CER与miR-136、miR-136与MMP13之间存在直接结合。结论:人脐静脉内皮细胞中存在circRNA-CER/miR-136/MMP13调控轴,circRNA-CER通过miR-136/MMP13轴调控了VEGF的表达。第三部分:CircRNA-CER通过miR-136/MMP13轴调控ox-LDL诱导后内皮细胞细胞的增殖、迁移等生物学行为。目的:观察circRNA-CER调控miR-136/MMP13轴对ox-LDL诱导后内皮细胞细胞的增殖、迁移等生物学行为的影响。方法:在过表达circRNA-CER的基础上联合miR-136 mimic或MMP13 siRNA,通过CCK8实验及EdU实验观察对内皮细胞增殖能力的影响,再通过流式细胞分析方法检测对细胞凋亡的影响。并进一步地通过划痕实验、transwell实验、成管实验检测对细胞迁移、侵袭及血管生成的影响。结果:在CCK8和EdU实验中结果显示miR-136 mimic或MMP13siRNA能显著减弱过表达circRNA-CER对细胞增殖的促进作用。在流式细胞术检测细胞凋亡的实验中,circRNA-CER的过表达抑制了内皮细胞的凋亡,而在此基础上联合miR-136 mimic或MMP13 siRNA的干预会抵消circRNA-CER的过表达抑制细胞凋亡的作用,使得发生凋亡的内皮细胞数目明显增多。在过表达circRNA-CER时,内皮细胞的迁移、侵袭及成管能力明显增强,而当联合miR-136 mimic或MMP13 siRNA时会抵消单独过表达circRNA-CER对细胞迁移、侵袭及成管能力的促进作用。结论:circRNA-CER通过miR-136/MMP13轴调控内皮细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为。