论文部分内容阅读
第一部分惊厥持续状态后幼鼠脑内AMIGO3和Lingo-1的动态变化目的:建立幼年小鼠惊厥持续状态（Status Convulsion,SC）模型,分析SC后不同时期幼鼠脑内AMIGO3和Lingo-1的动态变化。方法:选取C57/BL6幼鼠（生后21天龄,P21）,予以腹腔注射海人酸建立SC模型;设置同龄对照组（P22,P24,P25和P41）,分别于SC后1天,3天,5天和20天,采用免疫荧光检测AMIGO3和Lingo-1蛋白在幼鼠海马内的分布情况;Western blotting和ELISA检测幼鼠皮层内AMIGO3和Lingo-1蛋白的变化情况;RT-q PCR检测幼鼠海马内AMIGO3和Lingo-1 m RNA的变化情况。结果:（1）在SC后1天和20天,幼鼠海马内CA1、CA3和DG区分布着大量的AMIGO3和Lingo-1蛋白,与同龄对照组相比,AMIGO3和Lingo-1蛋白分布的轨迹和区域一致。（2）Western blotting检测显示:幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达在SC后7天与同龄对照组相比明显增加（1.54±0.10 vs 1.16±0.07,P＜0.05）,而Lingo-1蛋白表达在SC后1天,3天和20天与同龄对照组相比虽有增加趋势,但并未显示出统计学差异（P＞0.05）;ELISA检测显示:幼鼠皮层内Lingo-1蛋白表达在SC后1天（23.96±1.15 vs 15.84±1.27,ng/g）,3天（24.08±1.69vs 17.96±1.28,ng/g）,7天（29.91±1.55 vs 22.29±0.87,ng/g）和20天（22.68±0.64 vs 17.25±0.82,ng/g）与同龄对照组相比均明显增加（P＜0.05）。幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达在SC后3天（57.76±3.13vs 39.66±3.00,ng/g）,7天（57.95±2.61 vs 38.04±3.18,ng/g）和20天（66.02±2.99 vs 44.67±2.93,ng/g）与同龄对照组相比明显增加（P＜0.01）。（3）幼鼠海马内Lingo-1 m RNA表达在SC后1天,3天,7天和20天与同龄对照组相比并无显著差异（P＞0.05）;幼鼠海马内AMIGO3 m RNA表达在SC后3天与同龄对照组相比明显增加（1.44±0.19 vs 0.91±0.11,P＜0.05）。结论:SC后急慢性期幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达显著增加,与Lingo-1蛋白在幼鼠海马内分布轨迹和区域一致,提示AMIGO3蛋白也参与了SC后未成熟脑损伤的病理过程。第二部分调控AMIGO3蛋白表达腺病毒载体构建及转染验证目的:构建调控AMIGO3蛋白表达的腺病毒载体,并验证其经侧脑室注射至幼鼠脑内的功能。方法:采用RNA干扰技术构建过表达和干扰AMIGO3蛋白表达的腺病毒载体。将构建成功的腺病毒载体注射至幼年C57/BL6小鼠（P21）侧脑室内,用免疫荧光检测腺病毒携带的荧光蛋白GFP表达情况;然后用过表达AMIGO3蛋白腺病毒载体（p SE4551）、三种干扰AMIGO3蛋白表达的腺病毒载体（p AVE3001,p AVE3002和p AVE3003）和阴性对照腺病毒载体转染幼鼠,设置同龄对照组（P22,P24,P26和P28）,分别于转染后1天,3天,5天和7天采用ELISA检测幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达情况,验证不同种类腺病毒对AMIGO3蛋白的调控作用,并筛选出抑制效率最佳的干扰AMIGO3蛋白表达腺病毒用于下一步实验。结果:（1）腺病毒载体转染7天后仍可在幼鼠脑内观察到GFP蛋白表达。（2）注射过表达AMIGO3腺病毒p SE4551后1天（75.72±5.8 vs42.64±5.59,ng/g）,3天（75.31±4.27 vs 48.29±6.87,ng/g）,5天（88.9±3.68vs 43.17±4.78,ng/g）和7天（95.95±1.81 vs 44.98±4.38,ng/g）,幼鼠皮层内AMIGO3蛋白与同龄对照组相比均显著增加（P＜0.05）。（3）注射干扰腺病毒p AVE3003后1天（58.78±1.30 vs 86.00±4.11）、5天（57.40±7.04 vs 91.36±6.96）和7天（49.71±3.49 vs 76.57±6.80）,幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达较同龄对照组显著降低（P＜0.05）;注射干扰腺病毒p AVE3001后5天（60.45±5.82 vs 91.36±6.96）,幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达较同龄对照组明显减少（P＜0.05）;注射干扰腺病毒p AVE3002后1天、3天、5天和7天,幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达较同龄对照组无显著变化（P＞0.05）。结论:过表达或干扰AMIGO3蛋白表达的腺病毒载体可成功转染幼鼠脑细胞;侧脑室注射后1天即可明显增加或降低幼鼠皮层内AMIGO3蛋白的表达,其效果至少可持续一周;干扰腺病毒p AVE3003对幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达的抑制作用最佳。第三部分调控AMIGO3蛋白表达对幼鼠脑内异常神经环路的影响目的:探讨调控AMIGO3蛋白表达是否能改善持续惊厥状态后幼鼠脑内神经元轴突、髓鞘及突触损伤。方法:采用过表达AMIGO3蛋白腺病毒载体（p SE4551）、干扰AMIGO3蛋白表达腺病毒载体（p AVE3003）和阴性对照腺病毒载体分别转染幼年C57/BL6小鼠（P21）,于侧脑室注射5天（P26）后AMIGO3蛋白表达水平明显改变时,采用腹腔注射海人酸建立SC动物模型。按照转染病毒的不同,分别设立p SE4551+SC组（OAV+SC）、p AVE3003+SC组（AV+SC）和阴性对照+SC组（NC+SC）,此外设置正常同龄对照组和SC模型组（P27,P31和P46）,分别于SC后1天、5天和20天,采用透射电镜观察各组幼鼠海马内髓鞘和突触结构改变;Western blotting检测各组幼鼠皮层内MBP、Nogo A、MOG、MAG、Glu R1、Glu R2、Glu R3和Glu R4蛋白的表达情况。结果:（1）与同龄对照组相比,SC后急慢性期可见幼鼠海马内髓鞘分层、塌陷、空泡化,轴突线粒体肿胀;抑制AMIGO3蛋白表达后能减轻SC后急慢性期幼鼠海马内髓鞘结构损害;促进AMIGO3表达后加重SC后急慢性期幼鼠海马内髓鞘结构损害。（2）促进或抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠海马内神经元髓鞘厚度与SC组相比无明显改变。（3）在SC后20天,幼鼠皮层内MBP蛋白表达与同龄对照组相比明显减少（1.09±0.09 vs1.81±0.18,P＜0.05）;与SC组相比,抑制AMIGO3蛋白表达在SC后1天（1.28±0.14 vs 1.12±0.18）和5天（1.13±0.07 vs 1.54±0.23）能够明显增加幼鼠皮层内MBP蛋白表达（P＜0.05）。（4）幼鼠皮层内MAG表达在SC后1天（2.41±0.31 vs1.06±0.20）和5天（1.77±0.17 vs 0.87±0.06）与同龄对照组相比显著增加（P＜0.05）;促进AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内MOG蛋白表达在SC后20天较SC组明显增加（1.75±0.06 vs 1.18±0.09,P＜0.05）。（5）幼鼠海马内突触数目在SC后1天（7.75±0.48 vs 17.25±0.85,个/视野）和5天（5.5±0.28 vs 14.25±1.11,个/视野）与同龄对照组相比显著减少（P＜0.05）;抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠海马内突触数目在SC后1天（6.75±1.10 vs 7.75±0.48,个/视野）和5天（7.50±0.64 vs5.5±0.28,个/视野）较SC组显著增加（P＜0.05）。（6）幼鼠海马内PSD厚度在SC后1天（21.41±0.93 vs 31.57±1.25,nm）,5天（14.91±0.49vs 21.68±0.71,nm）和20天（26.46±0.96 vs 35.63±0.75,nm）与同龄对照组相比均明显减小（P＜0.05）;促进AMIGO3蛋白表达后幼鼠海马内PSD厚度在SC后20天较SC组变薄（22.65±0.33 vs 26.46±0.96,nm,P＜0.05）;抑制AMIGO3蛋白表达在SC后5天（22.21±0.55 vs14.91±0.49,nm）和20天（36.3±1.18 vs 26.46±0.96,nm）可见幼鼠海马内PSD厚度增加（P＜0.05）。（7）幼鼠海马内突触前膜活性带长度在SC后20天较同龄对照组显著增加（596.9±26.75 vs 319.5±33.89,nm,P＜0.05）;促进AMIGO3蛋白表达在SC后1天幼鼠海马内突触前膜活性带长度较SC组显著增加（592.0±30.4 vs 351.6±9.01,nm,P＜0.05）;抑制AMIGO3蛋白表达在SC后1天（230.1±12.27 vs 351.6±9.01,nm）和20天（410.2±12.53 vs 596.9±26.75,nm）活性带长度较SC组显著减少（P＜0.05）。（8）在SC后1天,5天和20天,幼鼠皮层内Glu R1、Glu R2、Glu R3和Glu R4蛋白表达较同龄对照组无显著改变（P＞0.05）;促进或抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠海马内Glu R1、Glu R2、Glu R3和Glu R4表达较SC组无明显改变（P＞0.05）。结论:SC后急性期幼鼠皮层内轴突损伤因子表达增多,且SC后急慢性期幼鼠海马内髓鞘及突触超微结构可见明显损伤;抑制AMIGO3蛋白表达,可减轻幼鼠SC后急性期髓鞘和突触结构损伤;促进AMIGO3蛋白表达,可使幼鼠皮层内轴突损伤因子表达增多,加重SC后急慢性期幼鼠海马内突触超微结构损害。第四部分AMIGO3引起幼鼠脑内异常神经环路形成的作用机制目的:探索AMIGO3蛋白引起幼鼠脑内异常神经环路形成的机制。方法:采用过表达AMIGO3蛋白腺病毒载体（p SE4551）、干扰AMIGO3蛋白表达腺病毒载体（p AVE3003）和阴性对照腺病毒载体分别转染幼年C57/BL6小鼠（P21）,于侧脑室注射5天（P26）后AMIGO3蛋白表达水平明显改变时,采用腹腔注射海人酸建立SC动物模型。按照转染病毒的不同,分别设立p SE4551+SC组（OAV+SC）、p AVE3003+SC组（AV+SC）和阴性对照+SC组（NC+SC）,此外设置正常同龄对照组和SC模型组（P27,P31和P46）,分别于SC后1天、5天和20天,采用ELISA检测SC后各组幼鼠皮层中p-AKT,AKT,p-Rho A和Rho A的变化情况,计算出p-AKT/AKT和p-Rho A/Rho A比值。结果:（1）幼鼠皮层内p-AKT蛋白表达在SC后5天（9.74±0.53 vs14.43±0.53,μmol/L）和20天（8.88±0.50 vs 13.2±0.65,μmol/L）较同龄对照组明显降低（P＜0.05）;幼鼠皮层内AKT蛋白表达在SC后5天（19.15±0.91 vs 24.75±0.81,μmol/L）和20天（15.75±0.89 vs 23.49±0.81,μmol/L）较对照组降低（P＜0.05）;抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内p-AKT蛋白表达在SC后20天较SC组明显增加（11.91±0.74 vs8.88±0.50,μmol/L,P＜0.05）;抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内AKT蛋白表达在SC后20天较SC组明显增加（23.44±0.41 vs15.75±0.89,μmol/L,P＜0.05）;与SC组相比,在SC后1天,5天和20天,抑制或促进AMIGO3蛋白表达对幼鼠皮层内p-AKT/AKT比值无显著影响（P＞0.05）。（2）幼鼠皮层内p-Rho A蛋白表达在SC后1天（4489±276.3 vs 2719±284.8,pg/g）和20天（6438±295.0 vs3404±515.1,pg/g）较同龄对照组显著增加（P＜0.05）,幼鼠皮层内Rho A蛋白表达在SC后20天较同龄对照组显著增加（14489±883.7 vs9156±455.8,pg/g,P＜0.05）;抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内Rho A表达在SC后1天（2993±173.4 vs 4489±276.3,pg/g）和20天（2196±311.7 vs 3404±515.1,pg/g）较SC组显著减少（P＜0.05）。抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内p-Rho A蛋白表达在SC后5天（8736±773.3 vs 13796±628.9,pg/g）和20天（8561±652.2 vs14489±883.7,pg/g）较SC组显著减少（P＜0.05）;促进AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内Rho A蛋白表达在SC后1天较SC组显著增加（14390±410.8 vs 9334±792.4,pg/g,P＜0.05）,促进AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内p-Rho A表达在SC后5天显著增加（6332±314.6 vs4671±374.7,pg/g,P＜0.05）;抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内p-Rho A/Rho A比值在SC后20天较SC组显著降低（0.25±0.02 vs0.45±0.03,pg/g,P＜0.05）。结论:抑制或促进AMIGO3蛋白表达对SC后急慢性期幼鼠皮层内PI3K/AKT信号通路并无显著影响;抑制AMIGO3蛋白表达可下调SC后慢性期幼鼠皮层内ROCK/Rho A信号通路。