非洲菊（Gerbera hybrida）为菊科（Compositae）大丁草属（Gerbera Cass.）多年生花卉,全球花卉贸易的五大鲜切花之一,在多个国家被广泛应用于盆栽和园林种植。过去几十年非洲菊已培育出了大量的无性系品种和F1杂交品种,因其用途不同育种目标也不尽相同,但是培育更多的花色、花型和着色模式,早花或持续开花,高品质及高产量,以及生物胁迫和非生物胁迫的抗病虫和抗寒性等,对于所有类型的非洲菊品种都十分重要。杂交与近交是主要的非洲菊育种途径,并仍将在未来的非洲菊育种工作中承担关键角色,然而市场上大多数商业品种是由非洲野生种Gerbera jamesonii Bolus ex Hook.f.和Gerbera viridifolia（DC.）Sch.Bip.两个种的杂交选育而成,其遗传基础较为狭窄,为非定向的常规杂交育种带来一定困难。因此,拓宽育种途径和创新育种技术对提高非洲菊育种效率变得尤为重要。单倍体可转化为双单倍体,不仅可用来代替近交系作为杂交亲本选育高度纯合的F1杂交品种,而且单倍体和双单倍体也是遗传研究和基因组测序、序列组装、单体分析等基因组学研究的优良材料。本研究通过非洲菊未受精胚珠离体诱导培育单倍体和双单倍体,并利用具有目标性状的单倍体转录组测序开展抗寒分子机理、重组抑制基因克隆及表达研究,以期为非洲菊单倍性育种、抗寒育种、增加重组率和丰富遗传多样性等提供研究及理论基础。第一,非洲菊单倍体和双单倍体培育。本研究以45个非洲菊品种为研究材料,剥取舌状花开始着色期的未受精胚珠置于培养基中离体诱导,45个品种中29个诱导出不定芽,诱导率达64.4%,其中诱导率大于5%的有12个,大于10%的有3个,‘白马王子’的诱导率最高达18.2%,表明不同品种的胚珠诱导不定芽有显著差异;选取不定芽诱导率差异较大的‘白马王子’、‘阳光露’、‘红极星’、‘多利’4个品种,研究不同季节和4℃低温处理对其不定芽诱导的影响,结果表明,4个品种在冬季、春季均可诱导出不定芽,春季效果最好,平均诱导率达10.4%,秋季平均诱导率最低为4.8%。品种间差异大,‘白马王子’夏季诱导率达20%,诱导时间最短为39d,而‘多利’很难形成不定芽,诱导时间也较长。另外,4℃低温处理有利于不定芽诱导,与非处理对照相比,处理后平均诱导率提高了2-3%,处理后对诱导的时间影响不大,与非处理对照相比,‘白马王子’和‘红极星’诱导时间缩短1-5d;采用流式细胞仪对‘红极星’、‘白马王子’、‘阳光露’、‘鸿运当头’4个非洲菊品种胚珠诱导的再生植株的染色体倍性进行鉴定,522个再生株系中,288个株系为单倍体,染色体为25条,占55.17%。218个株系为二倍体,占41.76%。16个株系为混倍体,占3.07%,染色体数目介于25-50条之间。单倍体植株与对应的杂合二倍体植株相比,除了繁殖系数与倍性相关性无显著差异外,在植株鲜重增速、株高、花朵大小、植株发育等差异显著;采用秋水仙素对单倍体植株染色体进行加倍处理,结果表明,浓度为0.05%的秋水仙素处理4天的加倍效果最好,加倍率最高达42%。从处理方法来看,培养基中添加秋水仙素的处理效果要优于全株浸泡和茎尖浸泡。与单倍体植株相比,双单倍体植株叶片气孔保卫细胞较大,叶绿体更多,植株恢复了育性,但与杂合二倍体相比,育性较弱。本研究为非洲菊单倍体诱导提供了方法及研究基础,为其倍性育种、遗传研究与基因组学研究提供了理想材料。第二,非洲菊单倍体的抗寒性转录组分析。选取相对抗寒的非洲菊‘红极星’和不抗寒‘秋日’两个品种,通过高通量转录组测序,比较分析了非洲菊两个品种单倍体在低温处理（-2℃）下叶片的转录本,分别获得了9.50 Gb和9.59 Gb的转录组数据,共组装获得99160个Unigene,成功注释了58127个Unigene。分析非洲菊‘红极星’和‘秋日’转录组中共有的Unigene表达水平,筛选获得了19100个表达量上调基因和13931个表达量下调基因,并对上调表达基因中差异最大的前30个Unigene中20个被Nr数据库注释的Unigene进行研究,发现这20个差异表达的基因主要参与了碳代谢（carbon metabolism）、核苷酸代谢（nucleotide metabolism）、次级代谢（secondary metabolism）、转录调控（transcription regulation）和防御相关反应（defense related response）的代谢调控途径和通路,这些基因的分子调控通路基本上与多种非生物胁迫反应有关,推测非洲菊‘红极星’和‘秋日’的抗寒性差异于此有关。为了验证差异表达基因在非洲菊抗寒调控中的相关性,我们利用实时荧光定量q RT-PCR技术对20个注释的差异表达基因进行了表达量分析,q RT-PCR结果显示,有12个差异表达基因在非洲菊‘红极星’和‘秋日’之间表现出显著的表达差异,这与转录组检测的表达趋势一致。其中,非洲菊‘红极星’中的Unigene49221、Unigene49372、Unigene50734、Unigene44870、Unigene45349、Unigene45911、Unigene46132、Unigene48047、Unigene48068、Unigene48783和Unigene49105与非洲菊‘秋日’相比,具有显著的表达上调,表明这些基因与非洲菊的抗寒性有着极为密切的相关性,且主要与核苷酸代谢、转录调节、次级代谢产物合成和胁迫响应有关,本研究为进一步解析非洲菊抗寒分子机理提供了研究基础。第三,非洲菊重组抑制基因TOP3α的克隆及表达研究。根据非洲菊‘红极星’和‘秋日’单倍体植株转录组数据,进一步筛选获得了20个非洲菊减数分裂时期内参候选基因。通过荧光定量PCR对非洲菊20个候选内参基因在花蕾组织中的表达分析及其稳定性表达评价,鉴定了PGK2基因的稳定性最高,最适合作为非洲菊减数分裂过程中基因表达的内参基因。同时,还筛选获得了6个植物减数分裂时期的重组抑制基因（FANCM、TOP3α、RECQ4、FIGL1、RMI1和FLIP）,并利用RACE技术克隆了非洲菊重组抑制基因TOP3α的全长c DNA序列。非洲菊重组抑制基因TOP3α大小为2808 bp,编码了935个氨基酸,其中包括了三个结构保守的结构域TOPRIM、TOP1Ac和zf-GRF。通过不同植物重组抑制基因TOP3α的氨基酸序列对比发现,非洲菊TOP3α编码的蛋白序列与其他植物中的TOP3α氨基酸序列具有高度的相似性,其中与同一菊科植物刺菜蓟（Cynara cardunculus L.）和向日葵（Helianthus annuus L.）的TOP3α蛋白相似度最高,分别为90%和89%。这表明植物重组抑制基因TOP3α在不同植物的进化过程中具有高度的保守性,也间接表明非洲菊TOP3α的基因功能与在拟南芥中抑制植物减数分裂重组相关。以非洲菊减数分裂过程中的最适内参基因PGK2为参照,发现TOP3α基因在花苞组织中的表达量最高,随着花发育进程和雌雄配子的成熟,TOP3α基因的表达量依次递减,该表达模式表明TOP3α参与了非洲菊的有丝分裂和减数分裂调控进程,这也与报道的拟南芥TOP3α基因抑制植物减数分裂重组的基因功能一致。非洲菊重组抑制基因TOP3α的鉴定及其表达分析,为非洲菊育种提供了新方法和新途径,对增加其重组率、丰富遗传多样性、提高育种效率奠定了研究及理论基础。