赛葵黄脉病毒（malvastrum yellow vein virus,MaYVV）是双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒,该病毒伴随其β卫星（malvastrum yellow vein betasatellite,MaYVB）时能侵染番茄和多种田间杂草,对番茄生产具有潜在威胁。深入开展MaYVV/MaYVB起源、遗传进化及致病机理的研究对MaYVV/MaYVB的田间防控具有重要意义。已有针对MaYVV/MaYVB的研究主要包括病毒检测鉴定、遗传进化分析、病毒致病性等方面,有关该病毒的关键致病因子及其参与病毒致病的作用机理研究尚待开展。本论文通过基因过表达筛选出MaYVV/MaYVB的关键致病因子之一,即MaYVV编码的C4蛋白,并对其参与MaYVV/MaYVB致病的作用及对寄主生长发育的影响开展了相关研究。通过转录组测序全面分析了C4对寄主基因表达及其涉及的相关通路的影响;基于Y2H和Bi FC筛选到与C4互作的寄主因子JAZ1,明确了C4对JA应答的抑制作用;通过沉默、过表达技术分析了相关JA通路下游转录因子对MaYVV/MaYVB侵染的影响。本论文主要研究结果如下:1、MaYVV编码的C4蛋白对病毒诱导症状及积累量的影响利用PVX介导MaYVV和MaYVB各基因过表达发现,过表达βC1、V2、C1、C2、C4能加重PVX症状,其中C4过表达初期引起花叶、叶片皱缩及叶面泡状突起症状,随后植株叶片开始上卷、开花畸形。在15 dpi,PVX/C4接种植株体内病毒含量显著高于PVX空载体接种植株中的病毒含量。对MaYVV基因组序列进行分析发现,C4基因存在两个潜在的起始密码子。在不影响C1 ORF编码的氨基酸序列条件下,对C4 ORF进行突变发现,突变第一个潜在起始密码子后伴随MaYVB接种本氏烟,在10 dpi表现出与野生型MaYVV伴随MaYVB接种植株相似的卷叶及黄脉症状,在35 dpi时突变点发生回复且其他位点也有发生突变;当两个潜在起始密码子同时突变（MaYVVΔC4）后,伴随MaYVB接种本氏烟,10 dpi时诱导的卷叶症状明显减轻且在35 dpi时无突变回复。随后,将MaYVVΔC4单独及伴随卫星接种发现,MaYVVΔC4与MaYVV单独接种植株在15 dpi时均无明显病毒病症状;在伴随MaYVB共同接种本氏烟15 dpi时,MaYVVΔC4/MaYVB诱导的卷叶症状明显减轻。对植株体内病毒及伴随卫星进行检测发现,无论单独或伴随卫星接种,C4突变后植株体内病毒及伴随卫星的积累量均显著减少。2、C4表达回补MaYVVΔC4缺陷及其对细胞生长影响将野生型和转C4本氏烟接种MaYVV 10 dpi后,两组植株均无明显病毒病症状产生,转基因植株中MaYVV含量显著高于野生型本氏烟;伴随MaYVB接种10 dpi,野生型和转基因本氏烟均开始表现出卷叶和黄脉症状,转基因植株体内MaYVV和MaYVB积累量均显著高于野生型本氏烟。当转C4本氏烟接种MaYVVΔC4,野生型本氏烟接种MaYVV,在10、15和20 dpi时野生型植株体内MaYVV的积累量均显著低于转基因植株体内MaYVVΔC4积累水平;当转C4本氏烟接种MaYVVΔC4/MaYVB、野生型本氏烟接种MaYVV/MaYVB 15 dpi时,转基因植株体内MaYVVΔC4和MaYVB含量均显著高于野生型植株中病毒和卫星的含量。以上结果表明,C4蛋白能够促进MaYVV和MaYVB在植株体内的积累。对转C4本氏烟叶片进行半薄切片及光镜观察,结果发现,转基因植株叶片上下表皮细胞排列不规则,海绵组织和栅栏组织结构松散、部分叶肉细胞存在成簇堆积现象;通过DAPI染色和扫描电镜观察发现,转C4植株单位面积内细胞核、表皮细胞和气孔细胞个数显著增多,气孔细胞表面积无显著变化;除此之外,转基因植株体内cyc D3;1,cyc B1;4,cyc A1;1,upa7和CDKD3等5个细胞周期相关基因较野生型植株上调表达。通过接种16c植株发现,瞬时表达C4+35S:GFP 3 dpi时能够有效抑制PTGS,激发出绿色荧光。综上,C4蛋白能促进MaYVV和MaYVB积累,诱导寄主细胞周期异常并抑制PTGS。3、转录组测序分析C4对寄主内源基因表达的影响为了深入研究寄主对C4基因表达响应的分子机制,本研究通过转录组测序技术,从野生型和转C4本氏烟中分别获得44338和43996条基因。与野生型本氏烟相比,转基因植株中差异表达基因共3727条,其中2007条基因上调表达,1720条基因下调表达,这些差异表达基因共富集到1047条GO term,其中富集到cellular component的GO term共有124条,富集到molecular function的GO term共312条,富集到biological process的GO term共971条。差异基因主要富集在细胞过程、代谢过程、单组织过程、结合、催化活性、细胞、细胞区域部分等过程。通过KEGG富集分析发现差异表达基因主要富集到的通路为:植物激素信号转导、植物-病原物互作、次生代谢物生物合成、代谢途径等。随机选取10条差异表达基因进行表达量检测发现,这些基因表达趋势与转录组测序数据一致。在差异基因富集到的前20条通路中,植物激素合成通路（包括α-亚麻酸代谢通路、类胡萝卜素生物合成通路、二萜类化合物生物合成通路）、植物激素信号转导通路（JA、ABA、GA信号途径）以及植物-病原物互作通路多个基因发生差异表达,表明JA、ABA和GA途径受到C4蛋白影响,C4表达也引起寄主防御反应。4、MaYVV C4蛋白与JA通路抑制子JAZ1互作通过Y2H和Bi FC筛选到C4与JA通路抑制子JAZ1在细胞核处存在互作。分离到的Nb JAZ1蛋白具有典型的JAZ结构域,且与茄科植物的JAZ1氨基酸序列相似性较高。亚细胞定位分析表明C4蛋白在细胞核和细胞膜均有分布,JAZ1主要分布在细胞核,细胞膜上有微弱信号。对本氏烟不同组织中JAZ1含量进行检测发现其在花中表达量最高,在叶片中的表达量次之,在根中表达量最低。与野生型本氏烟相比,转C4本氏烟体内的JAZ1和JA通路标志基因PDF1.2均显著下调表达。利用Me JA喷施处理本氏烟并接种MaYVV/MaYVB,检测结果表明,与喷施0.8%乙醇溶液的对照植株相比,Me JA处理的植株表现卷叶症状时间延迟,且后期植株卷叶症状明显减轻;除此之外,与对照相比,Me JA处理后植株中MaYVV的积累量在7、10和12 dpi时显著降低,MaYVB在10 dpi时显著降低。这些结果表明,C4与JAZ1发生互作并抑制JA途径,Me JA能有效抑制MaYVV/MaYVB的侵染。5、JA下游转录因子对MaYVV/MaYVB侵染的影响通过转录组数据分析结合RT-q PCR验证,JA下游转录因子WRKY8、WRKY41和MYB44在转C4植株中下调表达。为进一步验证这三个转录因子在MaYVV/MaYVB侵染过程中的作用,利用TRV载体介导WRKY8、WRKY41和MYB44基因沉默后,于10 dpi检测到基因有效沉默后回接MaYVV/MaYVB,在20 dpi时,MYB44沉默植株表现出较对照组更严重的叶片卷曲症状,MaYVV和MaYVB积累量显著高于对照植株;WRKY41沉默并回接MaYVV/MaYVB 20 dpi时,植株表现的叶片卷曲症状与对照植株无明显差别,MaYVV和MaYVB的积累量与对照植株无显著差异。在WRKY8沉默并回接MaYVV/MaYVB 17 dpi时,植株表现出较对照组更严重的卷叶症状,MaYVV和MaYVB积累量显著高于对照植株。随后,通过PVX介导各基因有效过表达,结果表明,MYB44过表达引起叶面产生坏死斑且茎杆部分坏死,WRKY8和WRKY41过表达造成叶面坏死斑。回接MaYVV/MaYVB 20 dpi时,PVX/WRKY8和PVX/MYB44植株叶片表现出花叶症状,新叶出现轻微卷曲症状;PVX/WRKY41植株表现的花叶、卷叶症状与空载体对照相似。在PVX/WRKY8和PVX/MYB44植株体内,MaYVV和MaYVB含量较对照组显著降低,PVX/WRKY41植株体内MaYVV和MaYVB含量与对照组无显著差异。综上结果表明,WRKY8和MYB44对于MaYVV/MaYVB侵染具有抑制作用,WRKY41对MaYVV/MaYVB侵染无明显影响。本研究发现C4蛋白是MaYVV/MaYVB的致病因子之一。C4蛋白参与MaYVV/MaYVB诱导的卷叶症状形成,促进MaYVV和MaYVB在寄主体内的积累,扰乱寄主细胞周期并抑制寄主防御相关的PTGS。转录组分析表明寄主多个基因的表达在不同程度上受到C4影响,主要涉及到寄主防御相关途径。研究表明,4、MaYVV C4蛋白与JA通路抑制子JAZ1互作C4通过与JAZ1互作并抑制JA途径及其下游转录因子响应,从而促进MaYVV/MaYVB侵染。这些研究结果揭示了C4参与病毒致病的作用机理,为进一步研究寄主抗MaYVV/MaYVB侵染提供了理论依据。