生物发光是一种常见的自然现象,是萤光素酶催化底物氧化同时释放光能的过程。生物发光不同于荧光,不需要外界的激发光,因此不会产生光漂白、自发荧光等现象干扰实验结果;而且正常生物体的细胞组织不会发光,所以生物发光在应用中有快速、灵敏、背景信号低、信噪比高等优点。在各种生物发光体系中,萤火虫生物发光是目前研究最为完善、同时也是应用最为广泛的生物发光体系,目前已被广泛应用于化合物的高通量筛选、检测相关酶的活性、细胞示踪等领域。生物标记物是在正常生理过程、病理过程或者对治疗干预的药理反应中可以客观评估和测量的指标。蛋白酶是一种常见的疾病标记物,异常的酶活性与许多病理过程相关。生物发光探针配合生物发光成像技术（BLI）可以应用于酶活性的检测,因此开发相关疾病标记物的生物发光探针,并将其应用于标记物的检测以及标记物的生理功能研究中,将具有十分重要的意义。本学位论文的主要研究方向是通过萤火虫萤光素酶底物的修饰构建具有高灵敏度、高选择性生物发光探针,并拓展其在酶活性检测方面的应用,先后利用氨基萤光素6’-氨基修饰的cage策略开发了应用于泛酸巯基乙胺酶、成纤维细胞活化蛋白、γ-谷氨酰胺转肽酶活性检测的生物发光探针;根据生物发光酶诱导的电子转移效应BioLet开发了酪氨酸酶生物发光探针。以上探针在体外、活细胞、体内可以将待测酶的活性转化为生物发光信号,可以为相关酶的生物学功能研究提供更加直观便捷的工具,使目标酶在体内外的活性可视化,还可以应用于目标酶抑制剂的筛选。第二章将讲述开发的泛酸巯基乙胺酶生物发光探针。泛酸巯基乙胺酶是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定酶,在肝和肾中过度表达,具有各种生物功能,与炎症和一些代谢疾病相关。它可以将泛酸巯基乙胺水解成半胱胺（一种抗氧化剂）和泛酸（维生素B5）,泛酸也是辅酶A（CoA）生物合成的必需成分。到目前为止,很少有针对这种酶的分析方法,阻碍了对其生物学功能的进一步研究。在这项工作中,我们报告了一种具有高灵敏度的泛酸巯基乙胺酶生物发光探针的设计,合成和生物学评价,探针的检测限为1.14 ng/mL。该探针可以用于反映活细胞、组织研磨液、血浆和转基因小鼠体内泛酸酶的活性。转基因小鼠口服抑制剂实验和小鼠禁食模型证明了我们的探针在小鼠体内的生物发光强度与泛酸酶的活性有明显相关性,可用于泛酸巯基乙胺酶的体内检测。据我们所知,这是第一个实现体内泛酸巯基乙胺酶检测的探针分子。第三章将讲述我们开发的成纤维细胞活化蛋白生物发光探针。成纤维细胞活化蛋白（FAP）作为细胞表面糖蛋白的关键成员,在肿瘤和几种纤维化疾病的成纤维细胞中高表达。它是药物设计的潜在靶点,也被报道作为前药策略用于增加一些抗癌剂治疗窗口。在这项工作中,我们开发了第一个用于成纤维细胞活化蛋白活性检测的生物发光探针,检测限（LOD）为0.254 ng/mL,可用于体外评估FAP抑制剂的抑制效率。转基因小鼠和荷瘤裸鼠的体内实验验证了我们的探针可以反映体内内源性FAP活性。此外,我们还将该探针应用于测试博来霉素诱导的特发性肺纤维化（IPF）小鼠模型的肺匀浆中的FAP上调。第四章将讲述我们开发的γ-谷氨酰转肽酶（GGT）生物发光探针。GGT水平被认为是肝病和中风等疾病的生物标志物。此外,流行病学研究表明血浆GGT水平与患癌症的风险有关。我们设计并合成了具有高灵敏度和高特异性的生物发光探针,用于GGT在体内外的活性检测。GGT可以特异性的切除探针的γ-谷氨酰基,释放出原始底物氨基萤光素,底物与萤光素酶作用释放生物发光。当确认该探针在体外和活细胞中都有良好的表现后,我们将其应用于荷瘤小鼠模型中,该探针在体内有良好的生物发光成像效果。第五章将讲述我们开发的酪氨酸酶生物发光探针。酪氨酸酶是一种含铜酶,催化酚类和儿茶酚的氧化,是黑色素生物合成的关键酶。据报道,它的高表达与黑色素瘤和帕金森病有关。因此,开发一种用于研究酪氨酸酶活性的便利工具是具有重要意义的。在此,我们基于生物发光酶诱导的电子转移（BioLeT）机制,开发了一类新的酪氨酸酶生物发光探针。希望通过Biolet机制,猝灭生物发光,然后当化合物与酪氨酸酶作用后,释放生物发光。我们制备了具有4-羟基苯基乙基和3,4-二羟基苯乙基的两个氨基萤光素衍生物,它们具有不同的HOMO能级。带有4-羟基苯基乙基的氨基萤光素（HP-AL）具有比3,4-二羟基苯乙基（DHP-AL）的氨基萤光素更低的HOMO能级和更强的生物发光。当与酪氨酸酶一起孵育时,DHP-AL的生物发光显示出明显的生物发光增强效应。LC-MS研究分析表明DHP-AL和酪氨酸酶之间的反应与其他荧光探针不同,其氧化机理更加类似于黑色素的生成过程,并被顺利用于体外、活细胞内以及荷瘤小鼠模型中酪氨酸酶的生物发光成像。综上,本论文基于不同原理开发了用于四种酶活性检测的生物发光探针,这些酶的异常表达与不同疾病相关,并在相关动物模型中确认了探针的应用。这些探针构建了相关酶从体外到细胞再到动物体内的抑制剂筛选评价体系,部分抑制剂的开发也在进行中。相信这些探针也将在研究相关标记物的生物学功能和其在病理过程中的角色发挥重要的作用。