套细胞淋巴瘤（Mantle Cell Lymphoma,MCL）是一种不可治愈的非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin’s Lymphoma,NHL）,其约占NHL的 3-6%,预后差,具有侵袭性,诊断中位发病年龄为68岁,多数诊断时处于Ⅲ-Ⅳ期,中位生存期仅为3-5年。染色体t（11;14）（q13;q32）易位是MCL的遗传学特征,染色体易位导致细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）过表达是MCL发病机制的核心。细胞周期的紊乱、基因组的不稳定、DNA损伤修复机制的异常和表观遗传学也在MCL发生发展中起着重要作用,各方面相互联系,共同导致疾病的发生发展。目前MCL的治疗仍以传统全身化疗为主,如R-CHOP方案（利妥昔单抗+环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松）,可明显提高患者完全缓解率延长中位生存期。但部分MCL患者在治疗中出现了耐药,复发/难治MCL患者的治疗遇到了新的挑战,急需新的药物和治疗方案延长患者总生存期。基于MCL发病机制,研究开发新型靶向药物,为MCL患者带来了曙光。B细胞受体（B cell receptor,BCR）信号通路是B淋巴细胞生存和增殖的关键特异性通路。BTK（Bruton’s tyrosine kinase）是BCR信号通路中的关键调节因子,在MCL细胞中BTK过度表达,BTK抑制剂的发展为MCL患者带来了希望。伊鲁替尼（Ibrutinib,IBN）是口服、强效不可逆BTK抑制剂,2013年11月美国FDA批准IBN用于治疗复发/难治性MCL。目前,IBN是接受一线疗法后复发难治性MCL患者的首选药物。然而,另一项Ⅱ期临床试验发现,大约43%的MCL患者对IBN无响应或者初始治疗有效但在治疗12个月内复发,IBN治疗后一旦复发,患者1年生存率仅为22%。除了耐药性问题外,IBN在治疗中也会有出血,中性粒细胞减少和心房颤动等不良反应。据推测,这些不良反应与IBN的脱靶效应（与BTK以外的靶标结合）有关,如EGFR,FGR,FRK,HER2,HER4,ITK,JAK3,LCK,BLK和TEC等。高选择性BTK抑制剂可能会降低不良反应对患者更耐受。因此,探寻新的治疗方案和开发新型高选择性BTK抑制剂对MCL的治疗具有重要意义。本论文中,我们利用计算机辅助药物设计和药物化学原理等手段,对IBN的四苯氧基苯基疏水性基团、4-氨基吡唑并嘧啶芳杂环母核、哌啶环连接链和末端烯丙酰基进行改造,设计合成了 4个系列化合物（RA、RB、RC和RD）,测定了目标化合物对BTK激酶的抑制活性和对MCL细胞的抗增殖活性。发现了多个对BTK具有高度选择性的化合物,且其对MCL细胞株和MCL患者原代瘤细胞的抗增殖活性显著优于阳性药IBN。首先,运用片段拼接设计策略,我们设计合成了 1-取代苄基-4-氨基吡唑并嘧啶RA系列化合物,该系列主要考察改造IBN疏水性基团、连接链和末端取代基对生物活性的影响。体外抑酶实验结果显示,该系列多个化合物表现出较强的BTK抑制活性,化合物 RA-6a,RA-6b,RA-12i,RA-13a,RA-13b,RA-13c 和 RA-13e对BTK的IC50值分别是27、50、47、21、64、52和45 nM。在MCL细胞株的抗增殖实验中,该系列多个化合物表现出优于IBN的抗增殖活性,其中化合物RA-6a,RA-13a,RA-13c和RA-13e对MCL细胞株的IC50值小于1μM,相比IBN其活性提高了 3-24倍。我们选活性最好的化合物RA-6a和RA-13e进一步研究发现,低微摩尔浓度下化合物RA-6a和RA-13e可剂量依赖性地诱导Z138和Jeko-1细胞凋亡,化合物RA-13e处理Z138细胞24h可阻滞细胞周期在G1期。化合物RA-6a可显著降低MCL患者原代瘤细胞的存活,其抑制效力明显强于IBN。激酶选择性实验结果表明,相比IBN,RA-6a和RA-13e对BTK的激酶选择性更高,化合物RA-13e对除Tec激酶家族外的所测激酶基本没有抑制作用,提示我们对疏水性基团的优化有利于改善化合物的激酶选择性。接着,通过计算机辅助药物设计手段,我们得到了 1-取代哌啶-3-（6-苯氧基吡啶-3-基）-4-氨基吡唑并嘧啶RB系列和1-取代胺酰乙基-3-（6-苯氧基吡啶-3-基）-4-氨基吡唑并嘧啶RC系列化合物。体外抑酶实验结果显示,部分RB系列化合物具有较强的BTK抑酶活性,而RC系列则完全丧失了对BTK的抑制活性。体外MCL抗增殖实验表明,化合物RB2对MCL细胞的抗增殖活性最佳,对MCL细胞株的IC50值小于1μM,相比IBN其活性提高了 3-39倍。我们对化合物RB2进一步研究发现,低微摩尔浓度下化合物RB2可剂量依赖性地诱导Z138和Jeko-1细胞凋亡;在Z138细胞中,0.5μM的RB2处理Z138细胞24小时,可有效降低BTK及下游PLCγ2的磷酸化水平;化合物RB2还可显著降低MCL患者原代瘤细胞的存活,其抑制效力明显优于IBN;此外,激酶选择性实验结果显示,IBN对所测20种激酶具有较高的抑制活性,相比IBN化合物RB2具有更高的激酶选择性,RB2主要脱靶的是ATP结合口袋附近有半胱氨酸残基的激酶,对Blk,Bmx,Tec,Txk,EGFR和ErbB4表现出较高的抑制活性IC50值分别是10,6,36,104,147和292 nM,对其他所测激酶基本没有抑制作用。RC系列虽丧失了对BTK激酶的抑制活性,但大部分化合物对MCL细胞株的抗增殖活性与IBN相当甚至更优,我们选活性较好的化合物RC6测定了淋巴瘤激酶谱,期望可以找到其作用靶点,然而RC6对所测激酶均没有抑制作用,该系列化合物的作用机制仍需进一步研究。基于开环设计策略,我们改造IBN吡唑并嘧啶母核,设计合成了取代吡唑类化合物（RD系列）。该系列化合物丧失了对BTK的抑酶活性,却具有较强的MCL抗增殖活性。化合物RD12a,RD12b,RD15a和RD15b表现出最强的抗MCL活性,IC50值小于1μM,相比IBN其抗增殖活性提高了 3-28倍。该系列化合物可作为抗MCL药物继续研究,其确切的作用机制有待深入研究。文献报道,组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）抑制剂可以下调c-Myc蛋白的表达,在MCL细胞及IBN原发性耐药的MCL细胞中表现出显著的抗增殖活性;HDAC抑制剂可以增强MCL细胞中p27和p21的表达,引发细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡;HDAC抑制剂可以抑制Cyclin D1的翻译,下调Cyclin D1蛋白表达水平,Cyclin D1是MCL发病机制的核心;HDAC抑制剂还可上调抑癌蛋白p53表达水平,阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗MCL活性;HDAC抑制剂与BTK抑制剂联合用药具有协同抗肿瘤作用。在前期BTK抑制剂研究基础上,我们采用分子融合的单分子双靶点设计策略,设计合成了 4个系列BTK/HDAC双靶点抑制剂,并测定了目标化合物对BTK/HDAC的抑制活性和对MCL的抗增殖活性。1,3-二取代-4-氨基吡唑并嘧啶RI系列化合物主要考察不同连接链（Linker）,取代吡啶胺酰苯基与四苯氧基苯基作为疏水性基团和不同锌离子螯合基团（Zinc Binding Group,ZBG）对生物活性的影响。RI-a系列化合物以异羟肟酸作为ZBG功能团,考察疏水性基团和Linker对生物活性的影响。该系列大部分化合物对HDAC没有抑制作用,却保留了对BTK的抑酶活性。化合物RI-a5、RI-a8、RI-a9、RI-a11、RI-a12和RI-a13表现出较高的BTK抑制活性IC50值分别是26,16,19,21,10和7 nM。哌啶和吡咯烷作为Linker的化合物RI-a9、RI-a12和RI-a13对BTK抑酶活性和对MCL抗增殖活性与IBN相当。而亚甲基作为Linker的化合物RI-a14则完全丧失了 BTK抑制活性,我们推测可能是由于Linker过短导致的。RI-b系列化合物是以邻苯二胺作为ZBG功能团,考察Linker和疏水性基团对活性影响。该系列大部分化合物对HDAC的抑酶活性不理想,化合物RI-b12虽然对HDAC没有抑制作用,但具有优于IBN的BTK抑制活性（RI-b12 IC50=4 nM,IBN IC50=8 nM）,RI-b12对MCL的生长抑制活性与IBN相当,其可作为BTK抑制剂进行深入开发。化合物RI-b3对BTK和HDAC两个靶点都表现出了较强的抑制活性（BTK IC50=54 nM,HDACs IC50=1.5μM）,其对MCL的生长抑制活性明显强于IBN。接着,我们进一步探讨了 Linker长度对活性的影响,在RI-a9和RI-a14的结构基础上优化设计了 RI-c和RI-d系列化合物。实验结果与设想一致,延长Linker碳链长度,化合物对HDAC抑制活性从无到有逐渐增强。化合物RI-c3、RI-c4、RI-d1、RI-d2和RI-d3对BTK和HDAC两个靶点均表现出强的抑制活性,其中化合物 RI-c4 和 RI-d3 的抑酶活性最佳（RI-c4BTKIC50=31 nM,HDACs IC50=30 nM;RI-d3 BTK IC50=88 nM,HDACs IC50=37 nM）。化合物 RI-c4 和 RI-d3 也具有突出的抗MCL活性,对MCL细胞株的IC50值小于1μM,相比IBN抗增殖活性提升了 2-25倍。我们选活性最佳的化合物RI-b3、RI-c4和RI-d3进一步研究。化合物RI-b3、RI-c4和RI-d3在低微摩浓度时即可有效的诱导Jeko-1和Z138细胞凋亡,并且呈现剂量依赖性。化合物RI-b3、RI-c4和RI-d3对BTK敲除的Jeko-1（Jeko-ko）细胞的生长抑制活性明显弱于Jeko-1细胞,与阳性药IBN结果一致,表明抑制BTK是双靶点化合物发挥MCL生长抑制作用的重要途径。此外该系列BTK/HDAC双靶点化合物对IBN原发性耐药的MCL细胞株具有较强的抗增殖活性,这对MCL的治疗具有重要意义。本论文中,我们对IBN疏水性基团、母核、连接链及末端取代基依次进行改造获得了 4个系列72个化合物,在前期BTK抑制剂的研究基础上设计合成了 35个BTK/HDAC双靶点抑制剂,共107个小分子化合物。化合物均通过核磁共振氢谱、碳谱和质谱进行了结构确证。查阅文献证实,其均为新化合物,未见报道。化合物均进行了体外抑酶实验和MCL细胞的生长抑制活性研究。多个化合物表现出比IBN更强的MCL细胞抗增殖活性,以上研究结果为MCL靶向药物的进一步优化,及对苗头化合物的抗肿瘤机制研究,筛选抗MCL候选药物奠定了基础。