本研究目的是建立一种适于基层医疗机构使用和大样本群体筛查的简单、快速、准确检测GJB2基因176del16、235delC、299-300delAT三个致聋缺失突变的方法,并通过对GJB2基因三个致聋缺失突变在辽宁地区汉族健康无关个体和感音神经性耳聋患者及其亲属中的群体分布和家系遗传的调查,为耳聋患者特殊群体的婚配指导、产前诊断和产后早期诊断等提供分子生物学依据,为完善辽宁地区GJB2基因突变谱提供基础数据。　　 材料和方法：　　 1、实验样本:49位感音神经性耳聋儿童患者及其108位亲属(其中6例耳聋患者)的口腔脱落细胞样本,来源于辽宁省康复中心。通过填写调查问卷的方式排除非遗传因素致聋病史并经系统体检和听力检测(包括音叉试验和纯音测听)诊断为感音神经性耳聋。197例辽宁汉族健康无关个体血液样本,来源于中国医科大学法医血清教研室。　　 2、DNA提取:酚/氯仿法提取基因组DNA。　　 3、PCR扩增:在GJB2基因176del16、235delc、299-300delAT单个突变检测方法优化的基础上,构建由引物F1(5TGTGAACAAACACTCCACCAGCA3)、F2(5CACGTGGCCTACCGGAGAC3)和R3(5GAGCCTTCGATGCGGACCTT3)组成的复合扩增体系。反应总体系为20μl,包括DNA模板21μl,引物F1、F2和R1分别为:1.5μl、1μl和2.5μl,5μM dNTP1μl,10×PCR缓冲液2μl,Taq酶0.2μl,去离子水加至20μl。反应条件为94℃5min,94℃1min、61℃30s、72℃1min,循环31次,72℃5min。　　 4、GJB2基因突变检测:①限制性内切酶ApaI消化根据经琼脂糖凝胶电泳判断的PCR扩增产物浓度,分别取PCR扩增产物1.5-3μl,加ApaI(GGGCC▼C)内切酶1μl及酶切缓冲液(10L)2μl,补充双蒸水至20μl,在37℃水浴箱内消化3h。②聚丙烯酰胺凝胶电泳分离配制T=12％,C=5％非变性聚丙烯酰胺凝胶,大小为10cm×7cm×0.1cm。将加有1/6体积上样缓冲液的酶切产物10μl上样电泳,电泳缓冲液为1×TBE,电压220V,电泳5h。③判型根据聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带位置和数目差异判断各样品GJB2基因三个缺失突变基因型组合。　　 5、DNA测序分析:随机选取PAGE分型确定为不同基因型组合的样品各2例,进行DNA序列分析。　　 结果：　　 1、PCR复合扩增产物经限制性内切酶(ApaI)消化、聚丙烯酰胺凝胶电泳同步检测GJB2基因三个致聋缺失突变,检出了由6种泳动度不同的电泳谱带组成的7种基因型组合(Ⅰ-Ⅶ)。　　 2、GJB2基因7种基因型组合样品DNA序列分析结果与NCBI中公布的GJB2基因序列比对,确定了7种基因型组合的突变类型分别为:三个位点均无突变的基因型组合Ⅱ型:单一位点突变的基因型组合,Ⅰ型为235delC纯合,Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅵ型分别为235delC、176del16和299-300delAT杂合突变;两个位点组成的复合杂合基因型组合,Ⅴ型和Ⅶ为235ddC分别与176del16、299-300delAT构成的复合杂合。　　 3、群体调查结果显示,对照组中检出的基因型组合最少,只有Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅵ型三种,分别检出189、6和2例;病例组中检出除Ⅳ型外的六种基因型组合:Ⅰ型5例、Ⅱ型38例、Ⅲ型1例、V型2例、Ⅵ型1例和Ⅶ型2例;家系组中检出除Ⅴ型外的六种基因型组合:Ⅰ型1例、Ⅱ型87例、Ⅲ型13例、Ⅳ型2例、Ⅵ型4例和Ⅶ型1例。　　 4、根据不同基因型组合确定的GJB2基因176del16、235delC和299-300delAT三个缺失突变的频率分布病例组(2.04％、15.31％、3.06％)均显著高于对照组(0％、1.52％、0.51％)。　　 结论：　　 1、本研究建立的PCR复合扩增结合限制性内切酶ApaI消化的方法,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳谱型的差异能够同时准确判定GJB2基因三个(176del16、235delC、299-300delAT)致聋缺失突变的类型和基因型组合。　　 2、本研究建立的同步检测GJB2基因三个致聋突变的方法,具有操作简单、快速;判型准确、直观;检测费用低等特点,可满足基层医疗机构进行GJB2基因突变检测的需要。　　 3、辽宁地区18.37％感音神经性耳聋患者的分子学病因为GJB2基因三个致聋缺失突变。应用本研究建立的同步检测GJB2基因三个缺失突变的方法在指导婚配、产前诊断及产后早期诊断和干预等方面具有重要的应用价值。