2,3-丁二醇的生产符合绿色化工的要求,目前,2,3-丁二醇的生物法生产成为国内外的研究热点。对野生原始菌株进行改造是提高2,3-丁二醇产量的关键。本研究以实验室保藏的一株克雷伯氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)为出发菌株,通过传统的诱变方法结合现代分子生物学手段,得到—株遗传稳定性良好并且高产2,3-丁二醇的工程菌株,进而通过响应面法对该菌株产2,3-丁二醇摇瓶培养基和发酵条件进行了优化,从而进一步提高2,3-丁二醇的产量。对原始菌株进行多次UV诱变、He-Ne激光诱变、NTG诱变、UV和NTG复合诱变后,利用溶钙圈大小和产物耐受性对突变菌株进行初筛,HPLC法检测2,3-丁二醇产量进行复筛,最终获得了一株编号为KlebsiellaoxytocaU7HN9UN5N2的突变菌株,在未经过优化的条件下,该突变菌株产2,3-丁二醇量达到20.56±0.38g/L,比原始菌株 KO 提高了 30.12%;2,3-丁二醇得率为 0.32±0.76g/g,比原始菌株KO提高了 37.50%。该菌株经过生理生化试验和传代试验结果表明该菌株遗传稳定性良好。以具有2,3-丁二醇代谢途径的Klebsiellaoxytoca为出发菌株,分别PCR扩增到a-乙酰乳酸合成酶(ALS)、α-乙酰乳酸脱羧酶(ADC)、乙偶姻还原酶(AR)三个关键酶基因,分别与克隆载体连接,将重组克隆载体分别转至大肠杆菌中,回收目的基因条带转至多拷贝表达载体中,转化至优良克雷伯氏菌突变株后,使该酶过量表达,从而使碳源更多流向2,3-丁二醇途径。通过强表达产2,3-丁二醇的途径基因的方法,发酵生产2,3-丁二醇的产量有很大提高。采用响应面法对发酵培养基成分及发酵条件进行了优化。PB试验表明葡萄糖、酵母粉、KH2PO4具有显著影响效应;通过中心组合试验对影响产2,3-丁二醇的主要因素进行研究,获得最佳发酵条件:葡萄糖67.82g/L,酵母粉2.312 g/L,K2HPO43.5g/L,KH2PO40.967,(NH4)2SO43.0g/L,初始 pH 值为 7.0,以 5%的接种量接种于装液量为100mL的250mL三角瓶中,发酵6h时添加0.2%的CaCO3,35℃,150r/min振荡发酵48h。在此优化条件下发酵,2,3-丁二醇的产量又提高了35%左右,2,3-丁二醇的产量可达到24.55 g/L。本课题研究,对2,3-丁二醇高产工程菌的构建有一定指导意义。同时,也向2,3-丁二醇的工业化生产迈进了一步。