论文部分内容阅读
鹦鹉热衣原体是专性胞内革兰氏阴性菌,禽感染后能够引起禽衣原体病,人感染后通常表现为流感样症状。衣原体免疫需要高效的细胞免疫和体液免疫,商品化的鹦鹉热衣原体亚单位疫苗不能提供良好的细胞免疫应答。火鸡疱疹病毒(HVT)可以诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫,已经广泛应用于开发家禽的多价活载体疫苗。本研究首先建立了检测鹦鹉热衣原体抗体的间接ELISA方法和检测HVT病毒含量的实时荧光定量PCR方法,之后通过利用细菌人工染色体(BAC)技术构建表达pmpD-N基因的重组HVT活载体疫苗,并将该疫苗免疫鸡后评价其对马立克病毒和鹦鹉热衣原体的保护效果。PmpD-N ELISA方法的建立及初步应用：采用纯化的鹦鹉热衣原体PmpD-N重组蛋白为包被抗原,优化反应条件和检测限,建立检测抗体的间接ELISA方法。结果表明该方法敏感性为97.9%,特异性为100%,重复性好,与MOMP ELISA符合率为98.1%。该方法可以用于临床血清样品的检测,同时为本研究后续疫苗免疫后抗体水平的监测奠定基础。火鸡疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立：以HVT的sorfl区基因构建的重组质粒为标准品,建立检测HVT的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示获得的标准曲线循环闽值(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r2=0.99),熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,能检测到的最低模板浓度为7×10’拷贝/μL,对不同浓度的质粒重复检测得出的Ct值的变异系数最高仅为1.44%,并可以鉴别诊断HVT和CV1988。该方法可用于HVT病毒含量测定,同时为本研究后续检测HVT的体内外增殖情况提供了有效手段。pmpD-N基因重组HVT的构建：改造HVT感染性BAC克隆,使其分别表达带有CMV和EF-1 α启动子的pmpD-N基因,拯救重组BAC,体外鉴定重组病毒的相关特性。结果成功获得HVT重组病毒(rHVT-CMV-pmpD和rHVT-EF-1 α-pmpD)。Western-blotting和IFA分析表明二者均表达了PmpD-N蛋白,而且PmpD-N蛋白在rHVT-CMV-pmpD中的表达量是rHVT-EF-1α-pmpD的四倍。Confocal分析显示PmpD-N蛋白分布在细胞的胞核、胞浆和细胞表面。rHVT-CMV-pmpD的复制特性和野生型HVT一致,在体外进行连续传代到20代时仍能稳定表达PmpD-N蛋白,能够激活巨噬细胞。pmpD-N基因重组HVT免疫效力评价：采用8000PFU的rHVT-CMV-pmpD免疫1日龄SPF鸡,免疫后第8天腹腔攻毒马立克病毒强毒RB-1B,第36天喉头接种鹦鹉热衣原体CB7株,评价免疫保护效果。实时荧光定量PCR结果显示,rHVT-CMV-pmpD免疫鸡后在体内的增殖水平与野生型HVT无显著性差异。免疫后产生了针对PmpD-N的特异性抗体以及高水平淋巴刺激指数,CD4+细胞比例呈现显著性升高,诱导了高水平的Th1细胞免疫。攻毒超强毒马立克病毒后,免疫组鸡保护率100%,对照组鸡全部发病。攻毒鹦鹉热衣原体后,免疫组的病变指数显著性降低,喉头拭子排菌量和肺脏的细菌载量显著性下降。本研究构建的重组HVT活载体疫苗可以提供良好的免疫保护效果。综上所述,本研究建立的PmpD-N ELISA方法可以检测鹦鹉热衣原体的早期感染；建立的实时荧光定量PCR检测方法可以测定HVT的病毒含量；利用BAC技术成功构建表达PmpD-N的重组HVT活载体疫苗可以作为预防马立克病毒和鹦鹉热衣原体的候选疫苗。