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第一部分DNMT3B的表达与鼻咽癌组织的临床病理特点及预后的相关性
目的：探讨DNMT3B的表达与鼻咽癌临床病理特点的相关性以及对鼻咽癌患者预后的影响。
方法：分析公共数据库GeneExpressionOmnibus(GEO)中，DNMT3B在鼻咽癌组织及正常鼻咽上皮组织中表达的差异；考虑到GEO数据库中鼻咽癌样本量较小的局限性，以及TheCancerGenomeAtlas(TCGA)数据库中缺少特定的NPC样本，我们进一步利用TCGA数据库分析了DNMT3B表达在头颈部鳞癌(HNSCC)组织及正常头颈部组织中的差异。利用组织芯片，分析DNMT3B的表达与临床病理之间的相关性，Kaplan-Meier分析DNMT3B表达对鼻咽癌患者总体生存期(Overall Survival, OS)的影响。
结果：我们首先分析了来自GEO数据库的数据(GSE12452和GSE40290)，发现与正常鼻咽上皮样品相比，鼻咽癌样品中DNMT3BmRNA表达上调。TCGA数据库分析得到与正常头颈部组织相比，头颈部鳞癌样品中表达更高水平的DNMT3B。我们进一步从HNSCC中分离了40个配对样本，包括肿瘤与相邻的非肿瘤组织，以及详细的患者信息，得到了类似的结果。我们进一步进行了鼻咽癌组织芯片分析，以研究在组织水平，鼻咽癌中的DNMT3B蛋白表达情况。结果显示DNMT3B表达主要位于鼻咽癌细胞核中，在92/132(69.7％)的鼻咽癌样品中观察到DNMT3B的高表达，而在40/132(30.3％)中观察到DNMT3B的低表达。DNMT3B的表达与年龄，组织学分类或淋巴结分期无关，但与性别(P=0.029)，远处转移(P=0.004)和临床分期(P=0.006)显著相关。此外，Kaplan-Meier结果表明，DNMT3B的表达与鼻咽癌患者的总体生存期显著相关。高表达DNMT3B的鼻咽癌患者的总体生存率比DNMT3B低表达的患者低(P=0.0205)，表明DNMT3B高表达与鼻咽癌患者的预后不良密切相关。DNMT3B的表达水平与鼻咽癌患者的无病生存率无显著关系。此外，从TCGA数据中我们发现头颈部鳞癌患者中DNMT3B与总体生存期之间虽然没有显著关系，但DNMT3B低表达患者的5年总体生存率明显高于DNMT3B高表达的患者(51.9％对42.6％)。
结论：DNMT3B在鼻咽癌患者中高表达，且与鼻咽癌患者预后不良密切相关。
第二部分DNMT3B对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响
目的：检测沉默DNMT3B对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。
方法：克隆形成实验检测鼻咽癌细胞系CNE2和鼻咽癌放射抵抗细胞系CNE2-R的放射敏感性差异，验证CNE2-R放射抵抗细胞系是否构建成功。Immunoblotting实验检测CNE2和CNE2-R中DNMT3B蛋白表达的差异。Immunoblotting实验和qRT-PCR实验检测多种鼻咽癌细胞系(CNE2,HNE1,CNE1,和CNE1-LMP1)经过6Gy射线照射后不同时间点(0、6、12、24和48h)DNMT3B、DNMT3A和DNMT1的蛋白和mRNA表达变化情况。Immunoblotting实验检测上述4种鼻咽癌细胞系的DNMT3B的基础表达量。四种慢病毒Vector、shDNMT3B#1、shDNMT3B#2和shDNMT3B#3分别转染CNE2和HNE1,使用Immunoblotting和qRT-PCR检测其转染效率。应用克隆形成实验检测沉默DNMT3B对鼻咽癌细胞增殖及放射敏感性的影响。划痕和Transwell检测沉默DNMT3B对鼻咽癌细胞迁移、侵袭能力的影响。Immunoblotting和qRT-PCR实验检测沉默DNMT3B后，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白及mRNA的表达变化。
结果：根据剂量梯度递增的方法，构建的CNE2-R的存活率明显高于CNE2，表明CNE2-R构建成功，且DNMT3B在CNE2-R中高表达。Immunoblotting和qRT-PCR发现经6Gy剂量照射后，各鼻咽癌细胞系中DNMT3B的mRNA和蛋白水平均随着时间的延长而逐渐升高，而DNMT1和DNMT3A在mRNA和蛋白质水平对射线的反应在不同细胞系中呈现不一致，推测DNMT3B可能与鼻咽癌放射抵抗相关。与CNE1细胞系相比，DNMT3B在CNE2，HNE1和CNE1-LMP1中表达更高。我们选取CNE2和HNE1进行慢病毒转染沉默DNMT3B，来研究DNMT3B在鼻咽癌中的作用。Immunoblotting和qRT-PCR显示shDNMT3B#3的转染效率最佳，于是我们选择CNE2-shDNMT3B#3和CNE2-Vector、以及HNE1-shDNMT3B#3和HNE1-Vector细胞系来进行下一步实验。克隆形成实验发现沉默DNMT3B后，CNE2-shDNMT3B#3、HNE1-shDNMT3B#3相对于对照组，增殖能力被抑制；我们进一步联合不同剂量的射线(0、2、4、6、8、10Gy)，发现沉默DNMT3B可明显提高鼻咽癌细胞放射敏感性。另一方面，划痕和Transwell发现沉默DNMT3B抑制鼻咽癌细胞的迁移、侵袭能力。Immunoblotting和qRT-PCR检测EMT相关分子的表达情况，发现沉默DNMT3B后，特别是在HNE1中，上皮标记蛋白E-cadherin增加，而间充质标记蛋白N-cadherin和Vimentin减少。EMT标记分子的基因水平显示出相同的趋势。结果提示，沉默DNMT3B可抑制、逆转鼻咽癌细胞的EMT。
结论：射线能诱导DNMT3B在鼻咽癌细胞系中的表达，参与鼻咽癌获得性放射抵抗。沉默DNMT3B可提高鼻咽癌细胞的放射敏感性。此外，沉默DNMT3B后,E-cadherin的表达量增多，而间质相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达量减少，特别是在HNE1中，从而抑制鼻咽癌细胞EMT的发生，进而抑制鼻咽癌细胞发生迁移、侵袭转移。
第三部分沉默DNMT3B提高鼻咽癌细胞放射敏感性的作用机制研究
目的：研究DNMT3B调控鼻咽癌细胞放射敏感性的作用机制。
方法：流式细胞术检测沉默DNMT3B后，CNE2、HNE1细胞系细胞周期的分布情况。Immunoblotting实验检测沉默DNMT3B后，细胞周期相关蛋白p53、p21和CyclinD1的表达情况；qRT-PCR检测沉默DNMT3B后，p53和p21基因的表达情况。流式细胞术检测沉默DNMT3B后，CNE2、HNE1细胞凋亡的情况；Immunoblotting实验检测沉默DNMT3B后，细胞周期凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase3的表达情况。STRING数据库分析DNMT3B和p53、p21之间是否有直接(物理)或间接(功能)的关联。Methylation-specificPCR(MSP)和BisulfitesequencingPCR(BSP)检测沉默DNMT3B后，p53和p21启动子区域甲基化水平的变化。联合6Gy剂量的射线处理后，流式细胞术检测沉默DNMT3B，细胞凋亡率的变化，进一步证明DNMT3B与放射敏感性的关系。
结果：流式细胞术结果显示沉默DNMT3B后可阻滞鼻咽癌细胞周期于G1期，Immunoblotting检测发现细胞周期相关蛋白p53、p21蛋白水平均明显上调，CyclinD1明显下调；P53、p21基因表达也明显上调。沉默DNMT3B的同时，细胞凋亡率明显升高，凋亡蛋白Bax上调，抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调，此外Cleaved-caspase3表达也升高。STRING数据库分析进一步发现，DNMT3B有望通过表观遗传修饰来调控p53和p21。我们设计了多对p53和p21启动子区域的MSP、BSP的引物，MSP和BSP检测发现沉默DNMT3B后，p53和p21启动子区域去甲基化，致使p53、p21基因水平表达升高，p53/p21信号通路重新恢复、激活。6Gy的射线照射后，流式细胞术进一步验证得到，沉默DNMT3B可明显提高射线诱导的细胞凋亡，进而提高放射敏感性。
结论：沉默DNMT3B可通过DNA去甲基化，恢复并激活p53/p21信号通路，导致细胞周期G1期阻滞，进一步促进细胞凋亡，从而提高放射敏感性。因此，DNMT3B可能成为鼻咽癌放射增敏的潜在靶标。
第四部分沉默DNMT3B提高鼻咽癌细胞放射敏感性的体内研究
目的：体内动物实验探讨DNMT3B对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。
方法：构建动物裸鼠模型，随机分成4组，分别为CNE2-Vector空载组、CNE2-shDNMT3B#3沉默组、CNE2-Vector+放射组与CNE2-shDNMT3B#3+放射组，每组各6只。照射组给予8Gy剂量射线照射，记录移植瘤出瘤时间、肿瘤体积，18天后处死裸鼠，取出移植瘤并拍照称重。免疫组化检测相关蛋白DNMT3B、p53、p21和Cleaved-caspase3的表达情况。
结果：4组裸鼠全部成瘤，平均成瘤时间为3天。考虑到鼻咽癌细胞系对射线敏感，当肿瘤生长到12天时，给予放射组裸鼠局部8Gy射线照射。与CNE2-Vector组相比，CNE2-shDNMT3B#3组中的肿瘤较小且生长速率低，肿瘤重量显示相同的趋势。8Gy辐照后，照射组的肿瘤生长速度明显低于未照射组。值得一提的是，经照射的CNE2-shDNMT3B#3组中的肿瘤大小明显小于经照射的CNE2-Vector组的肿瘤大小，提示沉默DNMT3B后，可在动物水平提高鼻咽癌细胞的放射敏感性。肿瘤组织免疫组化显示，DNMT3B沉默后，相对于CNE2-Vector组，CNE2-shDNMT3B#3组中，DNMT3B的表达明显减少，p53和p21的表达增多，同时凋亡蛋白Cleaved-caspase3明显升高。
结论：沉默DNMT3B后，可在动物水平激活p53/p21信号通路，促进细胞凋亡，提高鼻咽癌细胞的放射敏感性。
目的：探讨DNMT3B的表达与鼻咽癌临床病理特点的相关性以及对鼻咽癌患者预后的影响。
方法：分析公共数据库GeneExpressionOmnibus(GEO)中，DNMT3B在鼻咽癌组织及正常鼻咽上皮组织中表达的差异；考虑到GEO数据库中鼻咽癌样本量较小的局限性，以及TheCancerGenomeAtlas(TCGA)数据库中缺少特定的NPC样本，我们进一步利用TCGA数据库分析了DNMT3B表达在头颈部鳞癌(HNSCC)组织及正常头颈部组织中的差异。利用组织芯片，分析DNMT3B的表达与临床病理之间的相关性，Kaplan-Meier分析DNMT3B表达对鼻咽癌患者总体生存期(Overall Survival, OS)的影响。
结果：我们首先分析了来自GEO数据库的数据(GSE12452和GSE40290)，发现与正常鼻咽上皮样品相比，鼻咽癌样品中DNMT3BmRNA表达上调。TCGA数据库分析得到与正常头颈部组织相比，头颈部鳞癌样品中表达更高水平的DNMT3B。我们进一步从HNSCC中分离了40个配对样本，包括肿瘤与相邻的非肿瘤组织，以及详细的患者信息，得到了类似的结果。我们进一步进行了鼻咽癌组织芯片分析，以研究在组织水平，鼻咽癌中的DNMT3B蛋白表达情况。结果显示DNMT3B表达主要位于鼻咽癌细胞核中，在92/132(69.7％)的鼻咽癌样品中观察到DNMT3B的高表达，而在40/132(30.3％)中观察到DNMT3B的低表达。DNMT3B的表达与年龄，组织学分类或淋巴结分期无关，但与性别(P=0.029)，远处转移(P=0.004)和临床分期(P=0.006)显著相关。此外，Kaplan-Meier结果表明，DNMT3B的表达与鼻咽癌患者的总体生存期显著相关。高表达DNMT3B的鼻咽癌患者的总体生存率比DNMT3B低表达的患者低(P=0.0205)，表明DNMT3B高表达与鼻咽癌患者的预后不良密切相关。DNMT3B的表达水平与鼻咽癌患者的无病生存率无显著关系。此外，从TCGA数据中我们发现头颈部鳞癌患者中DNMT3B与总体生存期之间虽然没有显著关系，但DNMT3B低表达患者的5年总体生存率明显高于DNMT3B高表达的患者(51.9％对42.6％)。
结论：DNMT3B在鼻咽癌患者中高表达，且与鼻咽癌患者预后不良密切相关。
第二部分DNMT3B对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响
目的：检测沉默DNMT3B对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。
方法：克隆形成实验检测鼻咽癌细胞系CNE2和鼻咽癌放射抵抗细胞系CNE2-R的放射敏感性差异，验证CNE2-R放射抵抗细胞系是否构建成功。Immunoblotting实验检测CNE2和CNE2-R中DNMT3B蛋白表达的差异。Immunoblotting实验和qRT-PCR实验检测多种鼻咽癌细胞系(CNE2,HNE1,CNE1,和CNE1-LMP1)经过6Gy射线照射后不同时间点(0、6、12、24和48h)DNMT3B、DNMT3A和DNMT1的蛋白和mRNA表达变化情况。Immunoblotting实验检测上述4种鼻咽癌细胞系的DNMT3B的基础表达量。四种慢病毒Vector、shDNMT3B#1、shDNMT3B#2和shDNMT3B#3分别转染CNE2和HNE1,使用Immunoblotting和qRT-PCR检测其转染效率。应用克隆形成实验检测沉默DNMT3B对鼻咽癌细胞增殖及放射敏感性的影响。划痕和Transwell检测沉默DNMT3B对鼻咽癌细胞迁移、侵袭能力的影响。Immunoblotting和qRT-PCR实验检测沉默DNMT3B后，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白及mRNA的表达变化。
结果：根据剂量梯度递增的方法，构建的CNE2-R的存活率明显高于CNE2，表明CNE2-R构建成功，且DNMT3B在CNE2-R中高表达。Immunoblotting和qRT-PCR发现经6Gy剂量照射后，各鼻咽癌细胞系中DNMT3B的mRNA和蛋白水平均随着时间的延长而逐渐升高，而DNMT1和DNMT3A在mRNA和蛋白质水平对射线的反应在不同细胞系中呈现不一致，推测DNMT3B可能与鼻咽癌放射抵抗相关。与CNE1细胞系相比，DNMT3B在CNE2，HNE1和CNE1-LMP1中表达更高。我们选取CNE2和HNE1进行慢病毒转染沉默DNMT3B，来研究DNMT3B在鼻咽癌中的作用。Immunoblotting和qRT-PCR显示shDNMT3B#3的转染效率最佳，于是我们选择CNE2-shDNMT3B#3和CNE2-Vector、以及HNE1-shDNMT3B#3和HNE1-Vector细胞系来进行下一步实验。克隆形成实验发现沉默DNMT3B后，CNE2-shDNMT3B#3、HNE1-shDNMT3B#3相对于对照组，增殖能力被抑制；我们进一步联合不同剂量的射线(0、2、4、6、8、10Gy)，发现沉默DNMT3B可明显提高鼻咽癌细胞放射敏感性。另一方面，划痕和Transwell发现沉默DNMT3B抑制鼻咽癌细胞的迁移、侵袭能力。Immunoblotting和qRT-PCR检测EMT相关分子的表达情况，发现沉默DNMT3B后，特别是在HNE1中，上皮标记蛋白E-cadherin增加，而间充质标记蛋白N-cadherin和Vimentin减少。EMT标记分子的基因水平显示出相同的趋势。结果提示，沉默DNMT3B可抑制、逆转鼻咽癌细胞的EMT。
结论：射线能诱导DNMT3B在鼻咽癌细胞系中的表达，参与鼻咽癌获得性放射抵抗。沉默DNMT3B可提高鼻咽癌细胞的放射敏感性。此外，沉默DNMT3B后,E-cadherin的表达量增多，而间质相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达量减少，特别是在HNE1中，从而抑制鼻咽癌细胞EMT的发生，进而抑制鼻咽癌细胞发生迁移、侵袭转移。
第三部分沉默DNMT3B提高鼻咽癌细胞放射敏感性的作用机制研究
目的：研究DNMT3B调控鼻咽癌细胞放射敏感性的作用机制。
方法：流式细胞术检测沉默DNMT3B后，CNE2、HNE1细胞系细胞周期的分布情况。Immunoblotting实验检测沉默DNMT3B后，细胞周期相关蛋白p53、p21和CyclinD1的表达情况；qRT-PCR检测沉默DNMT3B后，p53和p21基因的表达情况。流式细胞术检测沉默DNMT3B后，CNE2、HNE1细胞凋亡的情况；Immunoblotting实验检测沉默DNMT3B后，细胞周期凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase3的表达情况。STRING数据库分析DNMT3B和p53、p21之间是否有直接(物理)或间接(功能)的关联。Methylation-specificPCR(MSP)和BisulfitesequencingPCR(BSP)检测沉默DNMT3B后，p53和p21启动子区域甲基化水平的变化。联合6Gy剂量的射线处理后，流式细胞术检测沉默DNMT3B，细胞凋亡率的变化，进一步证明DNMT3B与放射敏感性的关系。
结果：流式细胞术结果显示沉默DNMT3B后可阻滞鼻咽癌细胞周期于G1期，Immunoblotting检测发现细胞周期相关蛋白p53、p21蛋白水平均明显上调，CyclinD1明显下调；P53、p21基因表达也明显上调。沉默DNMT3B的同时，细胞凋亡率明显升高，凋亡蛋白Bax上调，抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调，此外Cleaved-caspase3表达也升高。STRING数据库分析进一步发现，DNMT3B有望通过表观遗传修饰来调控p53和p21。我们设计了多对p53和p21启动子区域的MSP、BSP的引物，MSP和BSP检测发现沉默DNMT3B后，p53和p21启动子区域去甲基化，致使p53、p21基因水平表达升高，p53/p21信号通路重新恢复、激活。6Gy的射线照射后，流式细胞术进一步验证得到，沉默DNMT3B可明显提高射线诱导的细胞凋亡，进而提高放射敏感性。
结论：沉默DNMT3B可通过DNA去甲基化，恢复并激活p53/p21信号通路，导致细胞周期G1期阻滞，进一步促进细胞凋亡，从而提高放射敏感性。因此，DNMT3B可能成为鼻咽癌放射增敏的潜在靶标。
第四部分沉默DNMT3B提高鼻咽癌细胞放射敏感性的体内研究
目的：体内动物实验探讨DNMT3B对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。
方法：构建动物裸鼠模型，随机分成4组，分别为CNE2-Vector空载组、CNE2-shDNMT3B#3沉默组、CNE2-Vector+放射组与CNE2-shDNMT3B#3+放射组，每组各6只。照射组给予8Gy剂量射线照射，记录移植瘤出瘤时间、肿瘤体积，18天后处死裸鼠，取出移植瘤并拍照称重。免疫组化检测相关蛋白DNMT3B、p53、p21和Cleaved-caspase3的表达情况。
结果：4组裸鼠全部成瘤，平均成瘤时间为3天。考虑到鼻咽癌细胞系对射线敏感，当肿瘤生长到12天时，给予放射组裸鼠局部8Gy射线照射。与CNE2-Vector组相比，CNE2-shDNMT3B#3组中的肿瘤较小且生长速率低，肿瘤重量显示相同的趋势。8Gy辐照后，照射组的肿瘤生长速度明显低于未照射组。值得一提的是，经照射的CNE2-shDNMT3B#3组中的肿瘤大小明显小于经照射的CNE2-Vector组的肿瘤大小，提示沉默DNMT3B后，可在动物水平提高鼻咽癌细胞的放射敏感性。肿瘤组织免疫组化显示，DNMT3B沉默后，相对于CNE2-Vector组，CNE2-shDNMT3B#3组中，DNMT3B的表达明显减少，p53和p21的表达增多，同时凋亡蛋白Cleaved-caspase3明显升高。
结论：沉默DNMT3B后，可在动物水平激活p53/p21信号通路，促进细胞凋亡，提高鼻咽癌细胞的放射敏感性。