使用干细胞的再生或修复治疗取决于在体外建立和优化干细胞培养体系，在移植的组织或者细胞中若没有含量充足的干细胞，治疗性角膜缘移植或体外扩增角膜缘细胞移植可能会失败或者不能维持长期有效性。因此，建立体外有效扩增角膜上皮干细胞的体系具有重要临床意义。本研究的目的就是利用小分子化合物来尝试建立一个有效的体外扩增角膜上皮干细胞的体系，并探究其可能的机制。
　　转化生长因子β(TransformingGrowthFactorβ,TGF-β)信号通路是调节眼组织细胞行为的重要信号通路之一，以往对TGF-β信号通路调控功能的研究主要集中在眼组织纤维化和炎症反应中。然而，TGF-β在眼组织和眼外组织中，均显示出具有抑制上皮细胞生长的作用。由于TGF-β是一种在不同的环境下即能抑制也能刺激细胞增殖的双向调节因子，因此我们检测了抑制TGF-β受体Ⅰ(TransformingGrowthFactorβReceptor1,TβR-I)介导的信号通路对在体外无血清和无滋养层条件下培养的原代角膜上皮细胞(Corneal Epithelial Cells, CECs)增殖和分化功能的影响。
　　我们用中性蛋白酶和胰蛋白酶从6-8周龄雌性C57BL/6小鼠的眼球中分离得到小鼠原代角膜上皮细胞(Corneal Epithelial Cells, CECs)，在含添加剂的成分确定的角质形成细胞无血清培养液(Defined Keratinocyte serum-free medium, defined KSFM)(完全培养液)中无滋养层培养。所有细胞被随机分为3组，在完全培养液中添加10μMSB-431542(特异性TβR-I抑制剂)培养的CECs为SB-CECs组；在完全培养液中添加10ng/mlSRI-011381(特异性TGF-β信号激动剂)培养的CECs为SRI-CECs组，完全培养液中未额外添加SB-431542或SRI-011381培养的CECs为对照CECs组。我们通过在光镜下观察比较各组CECs的生长速率和形态;通过检测角膜上皮干/祖细胞(Corneal Epithelial Stem/Progenitor Cells, CESCs/CEPCs)经典标志物p63、分化抑制因子1(Inhibitor of Differentiation, ID1)、细胞角蛋白12(Keratin 12, K12)、细胞角蛋白14(Keratin 14，K14)、转录因子PAX6、信号分子pSmad3、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和e-钙粘蛋白(E-cadherin, E-cad)等标志物的免疫荧光染色;通过p63的实时定量PCR(real time quantitative PCR, RT-PCR)分析、ID1的蛋白质印迹(western blot, WB)分析；以及集落形成试验(colony forming assay，CFA)、球体形成试验(sphere forming assay, SFA)、体外创伤愈合(healing wound in vitro)实验和气液界面(air-lifting interface， ALI)试验等方法，鉴定了细胞的属性和干性。
　　结果显示，应用TβR-I抑制剂组的SB-CECs传代稳定、持续扩增，扩增速度是对照组CECs的3倍左右。扩增的SB-CECs呈鹅卵石样外观，并且体积更小、排列更紧密；细胞内p63和ID1的表达均上调；集落形成能力和球体形成能力，以及在ALI条件下分化和形成复层角膜上皮样结构的能力，均优于对照组CECs。人角膜缘上皮细胞(Human Limbal Epithelial Cells，HLECs)的初步试验结果和小鼠CECs一致。
　　我们还发现，在原代提取的培养细胞和传代细胞中，以及在正常的角膜组织切片中，ID1的表达模式几乎和经典的CESCs/CEPCs标志物p63完全一致。鉴于ID1对抑制细胞分化起着重要的作用，并已被证实其表达在上皮细胞中受TGF-β信号通路负调控，因此由TβR-I阻滞剂所引起的ID1的去抑制，至少在一定程度上，可能是SB-CECs中的CESCs/CEPCs能持续扩增，以及ID1和p63的表达量一起同步上调的根本原因。
　　综上所述，在原代CECs的体外无血清无滋养层培养过程中，通过阻断TβR-I介导的信号通路，CESCs/CEPCs获得了长期有效的扩增，而ID1的去抑制可能是其根本原因。同时，ID1具有作为CESCs/CEPCs的标志物的潜质。这些研究结果能够帮助推进CESCs/CEPCs的相关基础和临床研究。