【摘 要】
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目的:肿瘤可通过高表达免疫抑制分子如纤维蛋白原样蛋白（Fibrinogen-like protein 1,FGL1）和程序性死亡受体配体 1（Programmmed death-ligand 1,PD-L1）等,分别与T细胞表面的抑制受体如淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3）和程序性死亡受体（Programmmed death-1,PD-1）等
【基金项目】
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CD147ab介导联合PD-L1化疗/免疫协同ROS敏感型智能肿瘤靶向递送系统，国家自然基金面上项目，编号:81773183，2018.1-2021.12；
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目的:肿瘤可通过高表达免疫抑制分子如纤维蛋白原样蛋白（Fibrinogen-like protein 1,FGL1）和程序性死亡受体配体 1（Programmmed death-ligand 1,PD-L1）等,分别与T细胞表面的抑制受体如淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3）和程序性死亡受体（Programmmed death-1,PD-1）等相互作用,直接抑制T细胞活化,导致T细胞无法发挥其效应与杀伤功能,发生免疫逃逸现象。为改善肿瘤免疫抑制微环境,本课题设计一种肿瘤微环境敏感型两亲性聚合物,以ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,PLL）为骨架,连接活性氧（Reactive oxygen species,ROS）敏感基团缩硫酮（Thioketal,TK）和顺乌头酸（Cis-aconitate,CA）。聚合物自组装成纳米粒,联合肿瘤穿透肽iRGD,向肿瘤部位递送siRNA-FGL1（siFGL1）和siRNA-PD-L1（siPD-Ll）,旨在探索提高肿瘤免疫治疗有效率和降低毒副作用的新策略。方法:（1）合成CA-PLL-TK聚合物,通过氢谱和红外图谱进行表征;制备纳米粒CPT-NPs,在体外考察其粒径、电位,并通过透射电子显微镜观察纳米粒形态特征;研究纳米粒的ROS响应性,对siRNA的吸附效率,酶保护作用及其体外安全性等性质;（2）通过MTT法考察纳米粒的细胞毒性;利用流式细胞术和共聚焦显微镜考察LLC细胞对纳米粒的摄取效率及胞内定位情况;利用Western Blot考察纳米粒的转染效率;（3）建立荷瘤小鼠模型,将纳米粒与肿瘤穿透肽iRGD共同静脉注射后,利用小动物活体成像技术考察纳米粒的靶向性及在肿瘤部位的积聚;共聚焦显微镜观察siRNA在肿瘤组织和血管中的分布;（4）探究各组载药纳米粒抑制肿瘤生长的疗效;通过Western Blot,免疫荧光及免疫组化考察T淋巴细胞在肿瘤组织的浸润;利用Elisa试剂盒和H＆E染色检测肿瘤组织细胞因子的分泌及肿瘤细胞的坏死情况。结果:（1）成功合成聚合物CA-PLL-TK,在水中自组装成纳米粒CPT-NPs;纳米粒在pH7.4条件下的粒径为75.9±0.98 nm,电位为6.2±1.8 mv;观察到纳米粒形态圆整,分布均匀,可响应高浓度ROS刺激;纳米粒通过静电作用吸附siRNA,保护siRNA不受酶降解,最佳质量比为40:1;（2）MTT法测得纳米粒具有良好的体外安全性;摄取实验结果表明纳米粒的摄取呈现时间依赖性;共聚焦显微镜观察到纳米粒在胞内发生溶酶体逃逸;体外转染结果表明纳米粒可以有效地将siRNA运载进入LLC细胞并在蛋白水平上发挥其基因沉默作用;（3）iRGD肽促进纳米粒在肿瘤部位积聚,观察到纳米粒具有良好的靶向性;共聚焦显微镜观察到iRGD明显增强纳米粒在肿瘤组织的渗透作用;（4）CPT-NPs/siFGL1/siPD-L1+iRGD组抑瘤效果最佳,肿瘤组织内FGL1和PD-L1蛋白表达下调,CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润增加,细胞因子的分泌水平提高,肿瘤组织免疫抑制微环境显著改善;在治疗过程中各组小鼠未出现明显的毒副作用。结论:本课题构建的ROS敏感型纳米粒与肿瘤穿透肽iRGD联合应用后,能显著提高纳米粒递送效率,并且作为一种新型安全、高效的基因递送载体,能靶向肿瘤部位递送siFGL1和siPD-L1,重新激活T细胞杀伤功能,为肿瘤免疫治疗提供一种新思路。
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