光与温度调控蒙古黄芪苗中毛蕊异黄酮与毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的积累及其分子机制的研究

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蒙古黄芪 (Astragalus membranaceus Bge.var. mongholicus(Bge.)Hsiao)属于豆科(Leguminosae)黄芪属(Astragalus L.)多年生草本植物。它的干燥根为我国著名的滋补类中药材,具有“补气”之功效,常用于止汗、增强免疫力、利尿和癌症的辅助治疗。异黄酮类化合物是这种药材的主要活性成分之一,毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷又是其中两种最主要的异黄酮化合物。然而不同产地的中药黄芪中这两种异黄酮化合物的含量差异很大,提示不同气候条件对中药黄芪中异黄酮类成分的积累具有调控作用。本文采用植物化学、分子生物学和生理学的方法,从化学、分子生物学和生理学三个层次对其主要活性成分毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷的含量变化、代谢途径中的相关基因的表达与温度和光照的关系及其抗氧化的生理表现进行了系统分析,获得如下结果: 1) 高效液相(HPLC)分析结果表明,温度升高或降低对16℃条件下培养100天的蒙古黄芪苗中毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷含量的影响截然不同。在根中,2℃低温处理会导致这两种次生代谢产物成倍积累;当苗被转移至25℃高温条件时,它们的含量会下降。在叶和茎中,毛蕊异黄酮都没有被检测到:在叶中,低温处理也会导致毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量上升,但在处理后期含量会下降;茎中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷在低温处理过程中含量同样会上升。黄芪地上部分是地下根低温积累这两种次生代谢产物所必须的,毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷可以通过黄芪的韧皮部转移到根。另外,低温诱导蒙古黄芪苗积累毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷必须依靠光的刺激。 2)克隆了毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷代谢途径中的7个结构基因的同源保守序列,包括肉桂酸-4-羟基化酶、查尔酮合成酶、查尔酮还原酶、查尔酮异构酶、异黄酮合成酶、异黄酮-3′-脱氢酶和毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷基转移酶,并获得了查尔酮合成酶基因的4个拷贝。 3)实时荧光定量RT-PCR表明,在茎和叶中,低温处理蒙古黄芪苗时,尽管参与合成毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的结构基因的表达模式有较大的差异,但它们的表达量总体上是上升的,这和低温诱导毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷积累的结果一致;而在根中,这些基因的表达量是下降的,但毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷含量却也是增加的。这些结果表明蒙古黄芪苗中各组织积累毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷的机制是不同的。 4)在叶中,温度升高和降低时,毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷代谢途径中结构基因的表达表现出明显的差异。只有苯丙氨酸裂解酶和肉桂酸-4-羟基化酶基因在低温诱导时,表达量迅速上升;而温度升高时,表达量下降,并以苯丙氨酸裂解酶上升或下降的速度最快。通过苯丙氨酸裂解酶抑制剂AOPP的应用以及苯丙氨酸裂解酶基因DNA序列5’端调控区的克隆与分析,表明低温调控蒙古黄芪苗积累毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷的“开关基因”是苯丙氨酸裂解酶基因。 5)初步分析了低温积累毛蕊异黄酮及其7-O-β-D-葡萄糖苷对蒙古黄芪苗的生理学意义。相关性分析表明,MDA的含量总与毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量呈极显著负相关,而与毛蕊异黄酮的含量负相关不显著。据此,作者推测在极端环境下,毛蕊异黄酮及其7-P-β-D-葡萄糖苷可能在蒙古黄芪苗体内发挥抗氧化作用。 本研究对中药黄芪的主要活性物质的积累及其分子调控的机制进行了探讨,为科学的种植中药黄芪原植物提供了新的研究模式,直接的理论指导。
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