研究背景红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase G6PD)缺乏症是人类最常见的遗传性酶缺陷病,呈X染色体连锁不完全显性方式遗传,全世界约有2-4亿人受累,我国分布呈“南高北低”的趋势。患者临床表现变化大,从无症状到新生儿黄疸、药物或感染造成的急性溶血、蚕豆病和重症慢性非球形红细胞溶血性贫血(CNSHA),严重者导致新生儿期重症核黄疸,造成死亡或永久性神经系统的损伤。该病的及早诊断和预防是我国优生优育工作的一个重要组成部分,检测是否存在G6PD缺乏,给患者合理的忠告,避免使用可能引起溶血的药物,合适处理由此引起的新生儿高胆红素血症,是该病的重点。G6PD缺乏症的分子基础是基因突变,G6PD基因位于Xq28,由13个外显子及12个内含子组成,全长20kb,是一典型的看家基因。随着G6PD基因结构的阐明和分子检测技术的发展,新的突变类型被不断发现。迄今世界上已报道140多种,G6PD基因突变具有以下特点:多为单个碱基置换的错义突变;大多数基因突变属于转化型突变,常发生在CpG二核苷酸内的C-T的转换;具有种族和地区异质性;尚未发现整个基因或大片段基因的缺失,也未见无义突变及移码突变;除外显子Ⅰ外,基因突变遍及其余外显子;具有复合突变。迄今为止,在中国人中共发现17种G6PD基因突变类型。它们分别是:A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1024T、G1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。不同地区人群基因突变类型和发生频率不同,同一地区不同民族基因突变类型也不同。资料表明,G6PD基因外显子上的G1376T和G1388A是中国人群G6PD缺乏者最常见的基因突变类型,其次为A95G和C1024T。在南方地区,如广东、广西、海南省G1376T、G1388A、A95G这三种突变占75.6%以上,G392T、C592T、G871A、C1024T这四种突变占10%-20%左右,其他稀少突变和未知突变占20%,因此G6PD缺乏在特定地区有热点突变类型,同时尚有相当比例的基因突变未被发现。常规的基因诊断方法,如等位基因特异性扩增(ARMS),错配碱基聚合酶链反应/限制内切酶图谱分析(miswatch-PCR/RE)、等位基因寡核苷酸探针杂交(ASO)等方法用于检测已知突变,聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性梯度凝胶电冰(DGGE)、温度梯度凝胶电冰(TGGE)等方法用于检测未知突变。但均存在检测效率低、漏检率高,不能确定基因型等不足。变性高效液相色谱(DHPLC)是近年来发展起来的一种新的核苷酸检测技术,是分离核苷酸片段及分析检测已知基因突变核单核苷酸多肽性(SNP)的最佳技术,为检测突变和SNP提供新的检测平台,DHPLC可以高通量、敏感而准确地检测已知DNA变异、发现新突变或多态性,自动化程度高,检测结果以图表显示,直观易判断,但技术复杂、费用昂贵、耗时长,只用于科学研究,目前尚难以在临床医院推广使用。目前检测G6PD缺乏症常用的筛查方法有①高铁血红蛋白还原试验法(MHBRT),该方法优点在于不需要昂贵的试剂或仪器,操作简单,可用于普查.但存在假阳性;②荧光斑点法(fluorescent spot test),该方法的优点是操作简单,假阳性低,缺点是需长波紫外光灯及氧化型谷胱甘肽(GSSG),判断结果受主观因素影响大;③硝基四氮唑蓝法(NBT),该方法只需使用普通的可见光光度计且试剂用量少;④高铁血红蛋白还原试验微量组织化学洗脱法(MHBRT microhistochemical elution method),该方法优点是对杂合子的检出率特别有效,但作为筛查法则过于繁琐,不适于临床常规使用。前三种方法对于G6PD正常、女性纯合子、男性半合子的灵敏度和特异度均很高,但对于女性杂合子检出率较低,分别为50%,30%,40%。即使是目前国际公认的G6PD缺乏症的确诊方法——G6PD/6PGD酶活性直接比值法(UVST)对于女性杂合子检出率也只有69.1%。能否通过改良优化现有实验方法提高对G6PD缺乏症尤其是女性杂合子的检出率进而提高对G6PD诊断的灵敏度呢?鉴于目前国内外少有对于该方面的研究,我们尝试性对目前国际公认的G6PD/6PGD酶活性直接比值法进行了试探性的改良优化和对比试验研究,并获得了可喜的结果。目的探讨采用不同的取样方法对国际公认的G6PD/6PGD比值法进行改良优化,并分别把两种改良方法(分别命名为改良方法B、改良方法C)与现用常规方法(方法A)对杂合子的检测进行对比研究,进而对改良方案做出评价,以提高女性G6PD杂合子的检出率,减少漏诊。方法从广东省人民医院病房和门诊送检的G6PD标本中抽取200例,每份标本分别用国际公认的G6PD/6PGD比值法以及两种改良的G6PD/6PGD比值法进行检测,双盲法与PE/DHPLC诊断结果进行对比,分析两种改良方法与常规方法对G6PD缺乏症检测结果及诊断结果的差异、符合率,总结三种方法对G6PD缺乏症杂合子的检出率。结果改良方法B的G6PD/6PGD比值、对疾病的诊断与常规方法A存在显著差异(t=7.622, p<0.05),灵敏度较常规方法A高;改良方法C的G6PD/6PGD比值、对疾病的诊断与常规方法A存在显著差异(t=17.141,p<0.05),灵敏度亦较常规方法A高。PE/DHPLC检测(特别是家系调查)结果表明改良方法C对女性杂合子的检出率为98%,常规方法A对女性杂合子的检出率为79.5%,改良方法B为92.0%。实验结果提示:改良方法C对于杂合子的检出率高于常规方法A与改良方法B。.结论:对国际公认的G6PD/6PGD比值法进行改良的方法C(以成熟红细胞加蒸馏水溶血)可提高G6PD女性杂合子的检出率,有望成为解决G6PD女性杂合子漏检的有效方法,同时,该改良方法可减少溶血素溶血对人体及环境造成的危害。