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葡萄糖激酶(GK)是一种存在于哺乳动物肝脏和胰腺中分子量为50 KDa的蛋白质,也被称为Ⅳ型己糖激酶,是糖酵解过程中的第一个限速酶。GK具有双重作用,肝脏中的GK参与葡萄糖磷酸化,加速糖原合成及葡萄糖代谢;胰腺中的GK为葡萄糖敏感器,促进高浓度葡萄糖状态下胰岛β细胞分泌胰岛素。GK功能异常将直接导致糖代谢紊乱,造成糖耐量异常及胰岛功能低下。实验证明,GK活性增加可促进葡萄糖的磷酸化,促进糖原合成和胰岛素释放,从而改善糖耐量异常,提高胰岛细胞功能,改善糖尿病症状。葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)是一种仅存在于哺乳动物肝脏中分子量为68 KDa的蛋白质,是GK的内源性抑制物,可与GK形成复合物而使GK失去活性。因此,GK和GKRP己逐步成为治疗糖尿病的新靶点之一,针对于该靶点的小分子GK激活剂及GKRP解离剂的寻找已经成为国内外研发治疗2型糖尿病药物的新热点。本文从人肝脏组织中克隆得到长度为1.4 kb的人源肝脏GK蛋白编码区的cDNA,连接毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K,以重组载体pPIC9K-GK转化毕赤酵母GS115。经过培养条件的摸索和发酵液的初步处理纯化,获得了重组人GK蛋白。对该重组蛋白进行活性测定后,证实其具有与天然GK蛋白一致的活性。经过对底物浓度、酶用量等一些因素的摸索和优化,利用重组人GK蛋白建立了GK激活剂筛选方法。同时,又从人肝脏中克隆得到长度为1878 bp的人源肝脏GKRP蛋白编码区的cDNA,连接大肠杆菌(E.coli)表达载体pET32a(+),以重组载体pET32a-GKRP转化大肠杆菌BL21trx(DE3),获得了重组人GKRP蛋白。除此之外,还将人GKRP蛋白编码区的cDNA连接毕赤酵母表达载体pPIC9K,以重组载体pPIC9K-GKRP转化毕赤酵母GS115,同样获得了重组人GKRP蛋白。这些具有活性的蛋白经过处理后,可用于小分子GK激活剂对GKRP抑制作用的研究。利用GK激活剂筛选方法,对定向合成和非定向合成化合物进行筛选,发现定向合成化合物LGK-01具有较强的GK激活活性。对LGK-01进行了酶学水平、细胞水平、动物整体水平及基因水平等多项研究,结果发现:1、LGK-01可增加葡萄糖磷酸化最大反应速率,降低底物葡萄糖的亲和性,降低GKRP对GK的抑制作用。2、LGK-01可增加HepG2细胞和3T3-L1细胞的葡萄糖消耗,促进NIT-1β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素的释放。3、LGK-01可促进HepG2细胞中GK蚩白由细胞核向细胞质的转移。4、LGK-01可改善肥胖性MSG小鼠糖耐量异常。5、LGK-01可改善高脂诱导C57BL/6J小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗,降低空腹血糖,抑制糖异生。6、LGK-01可增加高脂诱导C57BL/6J小鼠的胰岛素Ⅰ相分泌,促进肝糖原合成,增加肝脏GK活性。7、LGK-01可改善自发性2型糖尿病KKAy小鼠糖耐量异常和胰岛素抵抗,降低空腹血糖。8、LGK-01有轻微的PPAR_γ激活作用。结论1、利用异源表达获得具有活性的人源重组GK及GKRP蛋白。2、初步建立起GK激活剂筛选方法,并可利用异源表达活性GK及GKRP蛋白进行高通量化合物筛选。3、化合物LGK-01为选择性小分子GK激活剂,可促进肝脏对葡萄糖的利用,加快糖原合成,促进胰腺β细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放,可作为先导化合物深入研究。4、首次提出将GK激活作用和PPAR_γ激动作用相结合的思想,但LGK-01对PPAR_γ的激活作用尚不确定。