基于基因编辑构建表达β2m-HLA-G融合蛋白的低免疫原性人胚胎干细胞

来源 :浙江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:juwend5
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)具有在体外维持环境下自我更新及在特定分化条件下分化为三胚层细胞谱系的能力。因此,hPSCs可以作为理想的种子细胞为再生医学提供细胞移植所需的各类功能谱系。然而,hPSCs及其分化产生的功能谱系具有免疫原性,即移植由hPSCs分化获得的细胞/组织会诱发受体患者体内的同种异体免疫排斥反应,造成移植物的死亡。因此,构建低免疫原性hPSCs已经成为推动细胞替代治疗的核心环节。作为哺乳动物中普遍存在的最有效的同种异体免疫抑制案例,绒毛外滋养层细胞与母体子宫蜕膜直接接触,但是母胎屏障的存在有效地保护了作为同种异体抗原的胎儿免受来自母体免疫系统的攻击。母胎屏障的分子机制与人类白细胞抗原(human leukocyteantigen,HLA)直接相关。而绒毛外滋养外胚层细胞具有不表达HLA-A,-B,低表达HLA-C,高表达HLA-G蛋白质的特点。已有研究证明,该蛋白质分子能够抑制NK细胞、T细胞、DC细胞等多种免疫细胞的激活与杀伤作用。为了构建HLAⅠ表达缺失的hPSCs,我们设计了 B2M基因敲除的编辑方案。B2M是HLAⅠ型分子细胞膜定位的关键分子,敲除B2M的hPSCs的细胞膜表面将不表达任何HLAⅠ型分子。我们首先构建了一个高效、可精确控制且无需供体质粒的双gRNAs基因敲除系统,即通过将一对gRNAs与CRISPR/Cas9共同导入hPSCs,人为造成基因组相邻两个位点产生DSB,这两个DSB的平末端通过无缝连接后,可以产生一个提前终止密码子,从而阻止了非内源性蛋白质的翻译。利用这套双gRNAs敲除系统,我们成功的在人类多能干细胞中敲除了包括SMAD3和β-Catenin在内的十几个基因。另外,针对多个基因的敲除结果显示双gRNAs敲除系统可以同步对多个基因进行高效敲除。对于敲除非编码RNA,我们通过引入双gRNAs切除整段转录MIR1193的DNA序列实现了对该miRNA的敲除以及特异性切除MALAT1启动子核心区域的方案实现了对该lncRNA的敲除。我们设计的双gRNA敲除策略高效,适合敲除编码与非编码基因,可以实现多基因同步敲除,并且敲除后的基因产物可以进行精确预测。基于这一原理,我们成功的使用双gRNA基因敲除系统构建了内源性B2M基因敲除的低免疫原性hPSCs。为了构建细胞膜表面经典型HLAⅠ分子缺失,但是表达非经典型HLA-G的hPSCs,我们通过同源重组方案在人类胚胎干细胞内源性B2M基因的终止密码子位置插入了一段编码连接肽(G4S)4与HLA-G1的DNA序列,并在此细胞系的基础上,利用慢病毒载体,将一段编码B2M-(G4S)3-HLA-G5融合蛋白质的DNA序列引入该细胞系。我们的研究结果证明,B2M敲除hPSCs的细胞膜表面缺失β2m以及HLAⅠ分子。而过表达HLA-G的细胞系则成功表达β2m-HLA-G1与β2m-HLA-G5,其中流式细胞分析检测证明β2m-HLA-G1可以到达细胞膜表面且该融合蛋白的表达受内源性B2M基因启动子的调控,可以响应IFN-y的刺激。Western blot分析证明β2m-HLA-G5可以被分泌到细胞外培养环境中。同时,由于游离内源性β2m蛋白质的缺失,经典型HLAI蛋白质复合物无法完成组装,导致基因修饰后的人类胚胎干细胞系细胞膜表面缺失HLA-A、-B、-C蛋白质。体外与体内的同种异体免疫学实验证明上述表达HLA-G细胞系相较于野生型人类胚胎干细胞具有明显的低免疫原性。相比于B2M基因缺失的细胞系而言,表达HLA-G的细胞系能够更加有效的抑制NK细胞的激活。另外,β2m-HLA-G5分泌蛋白可以显著抑制野生型人类胚胎干细胞对NK细胞的激活,并且可以有效调控免疫细胞分泌的炎症因子。综上所述,我们成功构建了双gRNAs基因编辑系统,实现了在人类多能干细胞中高效,可预测的基因敲除。同时,我们成功实现了在人类多能干细胞中表达膜定位与分泌型的HLA-G蛋白,并且同时阻断了经典型HLAI分子在细胞膜表面的分布。该细胞系可以有效抑制T细胞、NK细胞诱导的免疫排斥,同时可以调节移植物周围的免疫环境,从而为广泛适用型细胞移植物提供了重要的细胞来源。
其他文献
本研究试图以社会网络分析的范式考察公共文化服务在基层的实践结构。在中国当前文化发展脉络下,文化作为合理化治理工具,表现于官方文化政策论述,同时又在官方与民间的互动过程中深入影响着个体到共同体之间不同的文化思维与应对政策的态度。然而在硬软件仍依赖政府、机构资源的情况下,更需考察公共资源分配与联结的有效性,重新描述地方公共文化服务的不同位置的多元行动者及各行动者在关系中拥有的资源、技术、理性和思维。研
随着再生医学的兴起,利用组织工程支架和种子细胞修复受损组织/器官,成为近年来的研究热点。超临界流体技术,作为一种新型的绿色技术,有条件温和、不使用有机溶剂、操作简单等优点,逐渐在组织工程支架制备领域受到研究者的青睐。糖尿病是威胁人类健康的4种非传染性疾病之一,其患病人数逐年增长,糖尿病的根治变得迫在眉睫。利用组织工程的原理,将胰腺细胞负载于支架并植入体内;或是利用干细胞在体外高效地分化得到能分泌胰
金纳米粒子(AuNPs)在开发或设计新型抗菌物质以对抗多种食源性致病微生物方面发挥着重要作用。与其他金属纳米粒子相比,AuNPs具有最理想的性质(如稳定性、无腐蚀性和杀菌活性),因此在催化、生物成像、生物传感器、医学、生物学、食品安全和材料化学等领域有着广泛的应用。目前,AuNPs已经在生物学、医学和食品领域开展了深入研究,以帮助应对现有的和正在出现的致病菌的根除。与此同时,AuNPs也有助于消灭
21世纪初以来,二代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)的持续发展,使其成为细胞基因组转录组分析的有力工具。常规大量细胞转录组测序(RNA-Seq)技术需要上万个细胞,所测结果实际是一群细胞基因表达的平均值,并不能鉴别细胞之间基因表达的异质性。近二十年来,单细胞测序技术飞速发展,并且广泛应用于胚胎发育、癌症、免疫等研究领域。但是目前的单细胞转录组测序技术仍然存在
TGF-β信号通路是广泛调控生物体生命活动最重要的信号通路之一。TGF-β可以通过促进p15、p21、p57等抑癌基因的表达以及下调c-Myc等原癌基因的表达,从而抑制细胞增殖,以维持细胞正常的增殖稳态。因而,在多种癌症中TGF-β信号通路被作为破坏的靶标以实现癌细胞的过度增殖。比如在白血病中,虽然白血病类型有很多,但TGF-β信号通路被普遍认为是受到抑制的。而且,多种实体瘤中TGF-β信号通路中
肺癌是影响人类健康的重大恶性肿瘤之一,其死亡率更是位居全球首位。其中,约85%的肺癌病人在组织病理类型上表现为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。由于NSCLC具有发病隐匿和高转移的特点,很多病人在确诊之初就已经发现肿瘤转移,导致病人错过最佳的手术治疗时间。这也是造成NSCLC病人死亡的主要原因。因此,深入研究NSCLC的致病机制,对于发现新的临床早期
极化激元在空间分布上的高度局域化传播为现代光学芯片集成与高速光学信号处理提供了一个新颖的思路。出于系统能耗的思虑,光学系统中有效载荷的有限激活与模块隔离均十分重要,对常规硅光芯片1310 nm或1550 nm的工作波长而言,其所需的隔离空间相应较大,这极大地限制了片上光学系统的集成度。相较于常规硅光芯片,石墨烯-六方氮化硼异质结构中支持的复合表面等离-声子极化激元可以在硅基芯片的基础上实现小于30
作为直接与外界环境接触的组织,呼吸道不仅为肺部提供温暖湿润的空气,更是对空气中有毒有害物质进行检测的第一道防线,而嗅觉、味觉等化学感觉信号通路便是呼吸系统细胞感知空气中外来刺激的重要途径。对呼吸道嗅觉、味觉受体及其下游信号通路的研究不仅能让我们更加深入地理解呼吸系统应激反应和固有免疫的调节,更能够带给人们仿生学上的灵感,将基础生物学的认识应用到先进传感器的设计之中。本文以呼吸系统中的化学感觉信号转
血管在成年哺乳动物心脏中以高度成型和组织化的血管网的形态存在,生血管的过程往往只在血管组织缺氧等生理因素刺激的条件下才会发生。在缺血性损伤的心脏中,由于心肌层中血管网有限的增殖能力无法满足心肌细胞对氧气的需求,最终导致心肌组织经历不可逆转的损伤。近些年的研究表明,心脏内源性cKit阳性细胞已被证实能够产生大量心脏内皮细胞但极少向心肌细胞方向分化,而内皮细胞的产生对生血管过程至关重要,因此,c-Ki
自身炎症性疾病是指在没有高滴度自身抗体或抗原特异性T细胞参与的情况下,机体发生非诱发炎症的一类遗传疾病,例如家族性地中海热,主要临床表现包括周期性发热、皮疹、CRP升高、淋巴结肿大、肝脾肿大、关节炎、炎症性肠病、血管炎、结节性多动脉炎、基底节钙化或肺间质病等多种形式的系统性炎症。发现新致病基因并深入研究致病机制对患者的精准治疗和研究基因的生理功能都有重要意义。RIPK1在死亡受体或模式识别受体介导