人多能干细胞（human pluripotent stem cells,hPSCs）具有在体外维持环境下自我更新及在特定分化条件下分化为三胚层细胞谱系的能力。因此,hPSCs可以作为理想的种子细胞为再生医学提供细胞移植所需的各类功能谱系。然而,hPSCs及其分化产生的功能谱系具有免疫原性,即移植由hPSCs分化获得的细胞/组织会诱发受体患者体内的同种异体免疫排斥反应,造成移植物的死亡。因此,构建低免疫原性hPSCs已经成为推动细胞替代治疗的核心环节。作为哺乳动物中普遍存在的最有效的同种异体免疫抑制案例,绒毛外滋养层细胞与母体子宫蜕膜直接接触,但是母胎屏障的存在有效地保护了作为同种异体抗原的胎儿免受来自母体免疫系统的攻击。母胎屏障的分子机制与人类白细胞抗原（human leukocyteantigen,HLA）直接相关。而绒毛外滋养外胚层细胞具有不表达HLA-A,-B,低表达HLA-C,高表达HLA-G蛋白质的特点。已有研究证明,该蛋白质分子能够抑制NK细胞、T细胞、DC细胞等多种免疫细胞的激活与杀伤作用。为了构建HLAⅠ表达缺失的hPSCs,我们设计了 B2M基因敲除的编辑方案。B2M是HLAⅠ型分子细胞膜定位的关键分子,敲除B2M的hPSCs的细胞膜表面将不表达任何HLAⅠ型分子。我们首先构建了一个高效、可精确控制且无需供体质粒的双gRNAs基因敲除系统,即通过将一对gRNAs与CRISPR/Cas9共同导入hPSCs,人为造成基因组相邻两个位点产生DSB,这两个DSB的平末端通过无缝连接后,可以产生一个提前终止密码子,从而阻止了非内源性蛋白质的翻译。利用这套双gRNAs敲除系统,我们成功的在人类多能干细胞中敲除了包括SMAD3和β-Catenin在内的十几个基因。另外,针对多个基因的敲除结果显示双gRNAs敲除系统可以同步对多个基因进行高效敲除。对于敲除非编码RNA,我们通过引入双gRNAs切除整段转录MIR1193的DNA序列实现了对该miRNA的敲除以及特异性切除MALAT1启动子核心区域的方案实现了对该lncRNA的敲除。我们设计的双gRNA敲除策略高效,适合敲除编码与非编码基因,可以实现多基因同步敲除,并且敲除后的基因产物可以进行精确预测。基于这一原理,我们成功的使用双gRNA基因敲除系统构建了内源性B2M基因敲除的低免疫原性hPSCs。为了构建细胞膜表面经典型HLAⅠ分子缺失,但是表达非经典型HLA-G的hPSCs,我们通过同源重组方案在人类胚胎干细胞内源性B2M基因的终止密码子位置插入了一段编码连接肽（G4S）4与HLA-G1的DNA序列,并在此细胞系的基础上,利用慢病毒载体,将一段编码B2M-（G4S）3-HLA-G5融合蛋白质的DNA序列引入该细胞系。我们的研究结果证明,B2M敲除hPSCs的细胞膜表面缺失β2m以及HLAⅠ分子。而过表达HLA-G的细胞系则成功表达β2m-HLA-G1与β2m-HLA-G5,其中流式细胞分析检测证明β2m-HLA-G1可以到达细胞膜表面且该融合蛋白的表达受内源性B2M基因启动子的调控,可以响应IFN-y的刺激。Western blot分析证明β2m-HLA-G5可以被分泌到细胞外培养环境中。同时,由于游离内源性β2m蛋白质的缺失,经典型HLAI蛋白质复合物无法完成组装,导致基因修饰后的人类胚胎干细胞系细胞膜表面缺失HLA-A、-B、-C蛋白质。体外与体内的同种异体免疫学实验证明上述表达HLA-G细胞系相较于野生型人类胚胎干细胞具有明显的低免疫原性。相比于B2M基因缺失的细胞系而言,表达HLA-G的细胞系能够更加有效的抑制NK细胞的激活。另外,β2m-HLA-G5分泌蛋白可以显著抑制野生型人类胚胎干细胞对NK细胞的激活,并且可以有效调控免疫细胞分泌的炎症因子。综上所述,我们成功构建了双gRNAs基因编辑系统,实现了在人类多能干细胞中高效,可预测的基因敲除。同时,我们成功实现了在人类多能干细胞中表达膜定位与分泌型的HLA-G蛋白,并且同时阻断了经典型HLAI分子在细胞膜表面的分布。该细胞系可以有效抑制T细胞、NK细胞诱导的免疫排斥,同时可以调节移植物周围的免疫环境,从而为广泛适用型细胞移植物提供了重要的细胞来源。