研究背景原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在东南亚和中国是最常见的恶性肿瘤之一，大量流行病学调查表明，长期慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是导致HCC的主要病因，感染HBV的人群患HCC的危险性是未感染者的100余倍，且HCC病人家庭内有HBV感染的聚集性倾向，提示HBV感染与HCC的发生密切相关。来自台湾的研究表明，在儿童实行接种乙型肝炎病毒疫苗后，肝癌发生率明显下降。HBV是含3.2kb基因组的部分双链DNA病毒，包含S、C、P和X 4个开放读码框(open reading frames，ORF)，其中X基因是最小的开放读码框，也是功能重叠最明显的区域。X基因(hepatitis B virus X gene，HBx)位于HBV基因组第1374～1838位核苷酸之间，编码约含154个氨基酸的多肽即HBx蛋白，分子量约为17kDa。在这4个开放读码框中，HBx基因常常更频繁地整合到宿主染色体上，编码的HBx蛋白能反式激活宿主及病毒调控基因，参与细胞调亡和受损细胞DNA剪切与修复，与HBV相关性肝细胞癌形成密切相关。而HBx基因在大多数肝癌组织上表达，表明HBx蛋白在调节与肿瘤相关的原癌蛋白和HCC抗凋亡方面发挥着重要作用。在HBV感染自然史上，突变势必蓄积在HBV基因组上。目前在一些进展性肝病病人中发现了某些类型的突变：HBx基因点突变，特别是K130M和V131I双替换，在肝硬化和肝癌病人出现的频率比轻型肝病更高；Chen等(2005年)在40％肝癌组织和70％肝癌病人血清中发现，HBx基因在204位置上插入突变(插入204AGGCCC)常伴随260(G→A)和264(G／C／T→A)位置上点突变，并在同一个病人或同一种样本中发现多种类型突变；在HCC癌细胞中，80％以上是整合型病毒，最保守的基因片段是HBx。整合的HBx基因部分缺失，使HCC癌组织中C-端截短的HBx蛋白检出率比非肝癌组织高。C-端截短的HBx蛋白失去了抗增殖作用，与原癌基因ras和myc一道，参与细胞转化。尽管HBV感染与肝细胞癌发生发展密切相关，但HBV诱发HCC的确切机制目前尚不十分清楚。研究目的(1)了解中国南部部分地区(包括湖南、湖北、江西等省)肝癌组织中HBV基因型的分布状况。(2)探讨肝细胞癌病人中是否存在特征性HBx基因突变。(3)构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体，研究HBx基因缺失型突变体与肝癌的关系。(4)建立稳定表达HBx-d382和HBx-d431蛋白QSG7701肝细胞株。(5)研究HBx-d382和HBx-d431缺失型突变体对永生化QSG7701肝细胞生物学行为的影响，探讨其克隆形成能力和致瘤性。研究方法(1)应用型特异性引物巢式PCR检测肝细胞癌组织中HBV基因型，并随机选择HBV携带者血清作为对照。(2)采用巢式PCR，单链构象多态性分析(single-stranded conformational polymorphism，SSCP)和异源性双链分析(heteroduplex analysis，HA)等方法对51份肝细胞癌组织石腊包埋标本和25份乙型肝炎病毒携带者血清HBx基因进行多态性分析，选择可能有突变的HBx基因进行克隆、测序，并与参考序列进行比对分析。(3)以pGM-T／HBx-d382和pGM-T／HBx-d431质粒为模板，采用PCR方法，分别扩增含Kpn I和Apa I酶切位点的HBx基因序列。pcDNA3载体及HBx基因PCR产物经上述两种酶双酶切后，在DNA连接酶作用下，将两者连接并转化到大肠杆菌DH5α中，经酶切鉴定和DNA序列测定，筛选出重组pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-d431质粒。(4)应用基因转染的方法，将质粒pcDNA3／HBx-d382、pcDNA3／HBx-d431、pcDNA3／HBx-2215和pcDNA3转染入QSG7701肝细胞中，筛选出稳定表达HBx蛋白的肝细胞株。(5)采用HE染色法，观察转染细胞形态学变化；通过MTT、软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪分析和裸鼠成瘤实验研究稳定转染细胞的生物学特性。研究结果(1)在35份分型的肝癌组织标本中，B基因型12份(34.3％)，C基因型17份(48.6％)，B＋C混合基因型4例(11.4％)，B＋D混合基因型2例(5.7％)。在60份HBV携带者血清中，B基因型28份(46.7％)，C基因型24份(40.0％)，B＋C混合基因型7例(11.6％)，B＋D混合基因型2例(1.7％)。C基因型在肝癌组织中占优势，而HBV携带者血清以B基因型为主。(2)肝癌组织中HBx基因存在点突变和缺失型突变，B和C基因型之间突变类型和数量有一定差异，C基因型点突变频率更高。肝癌组织中31.3％的HBx基因存在特征性带形。在4个随机选择具有特征性带形的样本中，HBx基因在nt382-400共同存在缺失突变并伴随29个点突变，导致读码框漂移，在nt1818位置上出现新的终止密码。4个样本中，3个是B基因型，1个未测出。在另一肝癌组织样本中，第一轮PCR扩增产生的片段比预期要短，经基因序列分析，结果在HBV nt1577-1840之间出现了264个碱基缺失。此外，一肝癌组织中HBx基因在nt431-445位置上缺失了15个核苷酸。(3)成功构建了重组pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-d431质粒，经DNA序列测定与比对，重组前后目的HBx基因片段一致。(4)成功建立了稳定表达羧基端截短的HBx蛋白肝细胞株pcDNA3／HBx-d382／QSG7701和pcDNA3／HBx-d431／QSG7701。(5)与转染空质粒pcDNA3相比，转染肝癌组织中HBx-d382和HBx-d431突变体及HepG2.2.15细胞株中HBx-2215基因的QSG7701细胞大小形态不一致、体积增大、核浆比例增大，生长速度更快，克隆形成率高(p＜0.05)。与转染空质粒pcDNA3 S期百分比(29.4％)和凋亡率(13.1％)比较，pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-2215组细胞S期百分比例增高，分别为32.8％和35.0％，pcDNA3／HBx-d431组凋亡率下降(4.5％)。除QSG7701组未成瘤外，其余在7周内均形成了肿瘤。转染HBx-d382和HBx-d431缺失突变体的QSG7701细胞在裸鼠体内2周成瘤，成瘤时间明显短于HBx-2215基因的5周和空质粒pcDNA3的6周。pcDNA3／HBx-d431组裸鼠成瘤率为50％(2／4)，其余成瘤组均为25％(1／4)。7周后测量肿瘤的体积，pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-d431组肿瘤明显大于pcDNA3／HBx-2215组和pcDNA3组。结论(1)中国南部部分地区肝细胞癌组织中存在基因型B、C，及混合基因型B＋C与B＋D，以C基因型为主，其次为B基因型。(2)HBx基因在肝细胞癌组织中频繁地发生突变，HBx基因在nt 382-400位置上的缺失突变可能在中国南部部分地区肝癌发生发展中发挥重要的作用。(3)成功构建了pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-d431真核表达载体，可为缺失型HBx基因突变体，特别是HBx-d382基因及其蛋白的生物学功能研究提供基因材料。(4)成功建立了pcDNA3／HBx-d382／QSG7701和pcDNA3／HBx-d431／QSG7701细胞模型，为HBx-d382和HBx-d431基因及其蛋白的深入研究奠定了基础。(5)HBx-d382和HBx-d431缺失型突变体能促进QSG7701细胞增殖和恶性转化，促使肿瘤的形成。HBx基因可能通过缺失型突变修饰其生物学功能，在HCC发生中起着重要的作用。