【摘 要】
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[目 的]新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染机体可引起严重的新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）。SARS-CoV-2感染已形成全球性大流行,给全球公共卫生与健康事业带来巨大的威胁。因此,严格控制和预防SARS-CoV-2的感染与流行是全球亟待解
【基金项目】
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国家自然科学基金（32170166）；
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[目 的]新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染机体可引起严重的新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）。SARS-CoV-2感染已形成全球性大流行,给全球公共卫生与健康事业带来巨大的威胁。因此,严格控制和预防SARS-CoV-2的感染与流行是全球亟待解决的事情。非结构蛋白14（Non-structure protein 14,Nsp14）是冠状病毒基因组复制中的校对系统元件,具有核酸酶活性,在病毒基因组复制过程中可剪切出现错配和突变的核苷酸,指导病毒基因组高保真性复制。当Nsp14功能缺失时,子代病毒扩增明显减低,甚至不进行扩增。因此,Nsp14在抗病毒治疗药物研发中展现出较好的研究前景。本研究通过原核表达系统制备SARS-CoV-2 Nsp14,并验证其酶活性。以期为靶向Nsp14的抗病毒治疗药物的筛选提供有利条件。[方法]1.获取不同冠状病毒的基因组序列,比较其Nsp14氨基酸序列的同源性。2.利用原核表达系统制备SARS-CoV-2流行株Nsp14蛋白:（1）根据大肠埃希氏菌的密码子偏好性,分析SARS-CoV-2流行株Nsp14蛋白编码序列的稀有密码子,将其进行密码子优化后克隆至4个不同的表达质粒进行表达;（2）通过比较不同表达质粒的表达产物的可溶性表达量,选择一个表达效果最好的重组表达质粒进行表达条件的优化;通过亲和层析、3C蛋白酶处理和凝胶过滤层析等方法纯化重组蛋白;（3）将纯化后的Nsp14蛋白与dsRNA混合进行酶切反应,通过尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Nsp14对dsRNA的剪切作用;（4）最后利用纯化后的Nsp14蛋白制备小鼠免疫血清,采用ELISA方法检测免疫血清的效价。3.利用昆虫表达系统制备SARS-CoV-2流行株Nsp14蛋白:（1）根据昆虫细胞的密码子偏好性,将Nsp14蛋白编码序列进行密码子优化后克隆至pFastBac1GP67载体,利用昆虫细胞进行表达;（2）最后利用原核表达系统制备的抗Nsp14小鼠免疫血清,通过Western Blot方法鉴定昆虫细胞的Nsp14表达产物。[结果]1.Nsp14的序列分析结果表明:Nsp14蛋白在新型冠状病毒中高度保守,同源性高达99.6%,在不同冠状病毒中的同源性约为61.4%。2.原核表达系统制备Nsp14蛋白的实验结果表明:（1）Nsp14的编码序列包含较多不利于大肠杆菌表达的密码子,一些主要的稀有密码子呈现近距离分布和串联分布。（2）比较4个重组表达质粒的Nsp14融合蛋白的可溶性后发现,pGEX6P1-GST-OPTIE-Nsp14重组质粒在大肠杆菌中的表达效果最好;（3）温度优化实验的结果表明,30℃为pGEX6P1-GST-OPTIE-Nsp14重组质粒的最佳表达温度;（4）SDS-PAGE和dsRNA酶切实验分析表明,经纯化后获得的不含融合标签的Nsp14蛋白纯度较高,该蛋白具有核酸酶活性,当Nsp14蛋白使用浓度为500nM以上时,剪切dsRNA的效果较明显;（5）利用Nsp14蛋白制备的小鼠免疫血清的抗体效价为1:8000～1:16000,免疫血清鉴定pFastBac1GP67-OPTⅡ-Nsp14表达于昆虫细胞后的Nsp14融合蛋白大部分在昆虫细胞内部。[结论]本研究利用原核表达系统成功地表达了 SARS-CoV-2 Nsp14融合蛋白,纯化后的Nsp14蛋白具有核酸酶活性,为进一步研究新冠病毒Nsp14的结构和功能奠定了基础,同时为筛选靶向Nsp14蛋白的抗病毒治疗药物提供了有利的条件。
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