猪圆环病毒2a/2b亚型毒株与猪细小病毒共感染的协同致病性研究

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猪圆环病毒2型(Porcine cirovirus type2,PCV2)目前被普遍认为是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。PCV2又分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因亚型,其中PCV2a和PCV2b毒株是猪群中流行的主要基因型。猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)可引发严重的母猪繁殖障碍性疾病,对养猪业危害严重。PCV2与PPV在世界养猪国家广泛流行,这二种病毒共感染情况十分普遍,深入研究二者共同感染的协同致病性作用具有重要意义。本研究从临床病例分离到一株PPV(HJ株),以其与实验室保存的PCV2a和PCV2b亚型毒株进行共感染试验,旨在阐明这二种病毒共感染的协同致病性作用;同时比较PCV2不同基因亚型毒株与PPV分离毒株共感染的协同致病性作用间的差异,为这两种病毒免疫防控提供科学依据。此外,还开展了猪Hokovirus (Porcine hokovirus, PHoV)与PCV2混合感染的流行病学调查。首先,从初产母猪流产胎儿的肠系膜淋巴结中分离到一株PPV,采用猪睾丸传代细胞系(ST)进行毒株传代,培育成一株细胞适应毒株,命名为PPV/HJ毒株。该毒株经ST细胞连续传50代,第25代起毒价显著提升,第40代毒价维持稳定(107.2TCID50/mL)。免疫电镜观察到PPV粒子与抗体结合形成的免疫复合物,呈实心小颗粒样粒子,直径约21nm。经病毒基因克隆测序证实,该毒株的NS1基因序列与GenBank中PPV/ZJ毒株同源性最高,达98.4%。用该毒株第50代培养物(1×107.2TCID50/mL)接种35日龄仔猪,临床未表现明显症状,剖杀后未观察到明显病理学变化,PCR法在猪的肺脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结、小肠中检测到病毒核酸,表明该毒株对易感动物具有一定的感染性。本研究分离的PPV/HJ毒株为进一步进行PCV2与PPV共感染试验奠定了基础。为阐明PCV2a和PCV2b亚型毒株与PPV/HJ毒株共感染的协同致病性作用,选用35日龄健康仔猪30头,随机分为6组,设计为PCV2a+PPV共感染组、PCV2b+PPV共感染组、PCV2a单感染组、PCV2b单感染组、PPV单感染组和未接种病毒对照组。感染后每日均观察临床表现,定期采血,同时称量猪的体重并记录。用流式细胞术检测血液中CD3+CD4-CD8+、CD3+CD4+CD8-细胞及粒细胞和单核细胞变化;用荧光定量PCR法检测组织中的PCV2载量及其排毒情况;用IPMA检测这2种病毒抗体消长变化;用ELISA法检测血清中的TNF-α和IFN-γ细胞因子变化。剖杀试验猪进行组织病理学观察。结果表明,与PCV2单感染组对比,PCV2与PPV共感染组的致病性作用显著增强。以PCV2b+PPV毒株共感染组引起的疾病临床症状和病理变化最为严重,试验猪脾脏、腹股沟淋巴结组织和血清中病毒载量显著高于其他组,粪便中排毒量也最高,TNF-α含量显著升高。研究表明,PCV2与PPV具有显著的协同感染致病性作用,PCV2b亚型与PPV共感染的致病性更强。为了调查我国猪群中PHoV与PCV2混合感染的流行情况,对来自全国15个省份共485份病料样品进行了PHoV和PCV2核酸检测,从PCR阳性样品中选择了具有地域代表性的11株PHoV进行了NS1基因克隆和测序,并绘制了遗传进化树。检测结果表明,PHoV与PCV2检测阳性率各为51.3%和36.3%,PHoV+PCV2混感阳性率为20.2%。被检样品中以淋巴结和脾脏样品中的PHoV阳性检出率最高,分别为79.1%和72.1%。同样,淋巴结和脾脏样品中PCV2阳性检出率分别为47.8%和46.5%,也是最高的。遗传变异分析显示,中国大陆与香港地区的PHoV流行毒株进化关系较近。本研究调查了PHoV及其与PCV2混合感染在中国大陆的流行情况,获得了11株PHoV遗传进化信息。PHoV在中国猪群中广泛流行,与PCV2混合感染十分普遍,推测PHoV可能是诱发PMWS的病原之一。
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