研究背景与目的:尿路感染(Urinary tract infections,UTIs)是临床上最常见的感染性疾病之一,多见于妇女、老年人和儿童。随着耐药菌株在全球的传播,UTIs的治疗成为临床一项严峻的挑战。虽然革兰阳性和革兰阴性细菌均可引起UTIs,但95%的社区获得性UTIs是由尿路致病性大肠埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)引起的。药敏试验表明,UPEC对常规抗生素的耐药率非常高,甚至已突破最后一道防线(如多粘菌素)。因此,迫切需要开发新型抗生素或方法来对抗UPEC。大多数常规抗生素影响细菌的生命结构合成。例如,甲氧西林和万古霉素靶向细菌细胞壁合成,多粘菌素靶向细胞膜,喹诺酮类抑制细菌生长过程中的关键酶。也有学者认为,抑制细菌毒力而不是杀死病原体可能是治疗细菌感染的另一种策略。多磷酸盐激酶1(Polyphosphate kinase 1,PPK1)是多种细菌病原体中的一种重要激酶,负责多聚磷酸盐(Polyphosphate,Poly P)合成并参与ATP代谢。研究表明,PPK1与细菌的运动性、生物膜形成、群体感应和毒力因子的表达密切相关,并且也是抗生素耐药性研究的重要靶点。我们前期研究发现,与野生型大肠埃希菌相比,大肠埃希菌ppk1基因敲除株的Poly P含量、黏附和侵袭能力均明显降低。另外,还发现Δppk1菌株在氧化刺激、高渗透压和酸性刺激下的存活率较差。而且研究发现,人类体内不存在PPK1的同源物。因此,PPK1或其编码基因有希望成为开发新型抗菌药物的作用靶点。目前为止,将PPK1作为靶点的新型抗菌药物的研究仍较少。为此,本研究拟通过计算机虚拟筛选的方法选定PPK1抑制剂,并利用生物学实验和动物实验研究其对UPEC致病性的影响,为开发新型抗菌药物治疗UTIs提供实验依据。研究方法:1.通过使用Schr?dinger Suite 2019中的模块来执行PPK1新型抑制剂的筛选流程。并且通过表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)分析评估PPK1与化合物之间的结合反应,以快速筛选候选化合物。然后,为了进一步研究化合物与PPK1之间的相互作用,使用SPR分析检测化合物与PPK1的结合力。并且为了更好地理解化合物与PPK1的相互作用,进行了分子对接研究。2.采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色法,测定化合物对PPK1酶活性的影响。3.通过测定细菌生长曲线来研究化合物对CFT073生长的影响。4.通过侵袭能力测定评估化合物对CFT073侵袭尿道上皮细胞的能力的影响。5.通过过氧化氢刺激实验评估化合物对CFT073抗氧化压力的影响。6.通过生物膜形成能力测定评估化合物对CFT073生物膜形成能力的影响。7.通过小鼠模型实验评估化合物在体内抑制UPEC感染的效果。实验结果:1.通过虚拟筛选和SPR分析,选择了化合物8和17作进一步研究。SPR分析显示,化合物8和17的单位分子量的响应值分别为4.073 100RU/Da和6.555100RU/Da,解离常数(K_D)分别为85.8μM和84.6μM。2.酶活性实验结果显示,与对照组相比,化合物8和17处理组的PPK1酶活性降低(P<0.05)。3.细菌生长曲线的结果显示,化合物8和17处理组的CFT073菌株的生长与对照组相比没有明显差别。4.侵袭实验和过氧化氢实验结果显示,与对照组相比,化合物8和17处理组的CFT073菌株的侵袭能力以及抗氧化压力能力减弱(P<0.05)。同时,生物膜形成实验结果表明,与对照组相比,化合物8和17处理组的CFT073菌株生物膜的形成能力减弱。5.动物实验的结果表明,与对照组相比,化合物8和17处理组的小鼠膀胱中的细菌载量明显降低(P<0.05)。同时,在两种化合物处理组中均可发现炎性细胞渗出、组织水肿和上皮损伤减轻的现象。实验结论:1.结合力研究和分子对接研究的结果证明化合物8和17可以直接与PPK1相互作用。2.化合物8和17可明显抑制PPK1的酶活性。3.化合物8和17在体外可有效降低UPEC(CFT073)的侵袭能力和抗氧化压力能力,但对该菌株的生长不产生明显影响;两种化合物在体内模型中均可减少小鼠膀胱中的细菌载量并减轻炎症反应。4.化合物8和17具有抑制CFT073生物膜形成的作用。5.PPK1抑制剂有潜力成为UPEC感染治疗的新型化合物。