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寻找活性氧(ROS)的来源从而清除ROS是目前防治动脉粥样硬化(AS)的重要措施之一。已知髓过氧化物酶(MPO)能催化过氧化氢成为次氯酸(强氧化剂),是参与AS形成的重要酶类。新近发现的一种新的过氧化物酶一血管过氧化物酶(VPO)是MPO的一种同工酶,与MPO只存在于中性粒细胞和单核巨噬细胞中不同,VPO主要存在于血管内皮细胞和平滑肌细胞,与MPO具有相似的结构特征和生物学活性,提示VPO可能与动脉粥样硬化发生发展密切相关。
因此本项目拟在冠心病患者中探讨血浆VPO1的水平变化及相关性,并从分子细胞水平,运用转染VPO1 shRNA等分子生物学技术,进一步探讨VPO1在内皮细胞凋亡中的作用及其机制。本项目有助于阐明VPO1的致AS作用,为AS的防治提供新的理论依据。
第一部分、冠心病患者血浆VPO1变化及相关性研究
目的:本研究旨在观察冠心病患者血浆中血管过氧化物酶(VPO1)的变化并探讨其与冠心病的相关性。
方法:共纳入221名冠心病(CAD)患者及60名健康体检者,所有研究对象分为三组,急性冠脉综合征组(ACS)118名,稳定型心绞痛组(SAP)103名和正常对照组(Control)60名。采用酶联免疫法(ELISA法)和Western-blot法检测血浆中VPO1和MPO浓度及蛋白表达;采用透射比浊法检测血清hs CRP水平;采用ELISA法检测血浆中氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)水平。比较不同类型冠心病及正常对照组血浆中VPO1,MPO,hs CRP和ox-LDL含量变化,进行相关性分析。
结果:
(1)ACS组和SAP组患者血浆中VPO1和ox-LDL水平显著高于正常对照组(P＜0.01),且ACS组显著高于SAP组,差异具有显著性(P＜0.01):
(2)hs CRP和MPO在ACS组但均高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),但SAP组和正常对照组浓度差异无显著性(P＞0.05);
(3)冠心病(ACS组+SAP组)患者血浆中VPO1与ox-LDL呈显著正相关,与MPO,hs CRP无相关。
结论：:冠心病患者血浆VPO1浓度显著升高,可能与其发生发展密切相关。
第二部分、VPO1在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中的作用及机制探讨
目的:从分子绌胞水平,运用转染VPO1shRNA等分子生物学技术,系统探讨VPO1在内皮细胞凋亡中的作用及其机制。
方法:实验分为三个部分。
(1)研究ox-LDL对内皮细胞凋亡和VPO1蛋白表达的影响。采用Hochest染色和流式细胞仪检测内皮细胞凋亡;采用Western-blot法检测VPO1蛋白表达。分组如下:量效实验:随机将培养的6孔板细胞分为4组:对照组和不同浓度的ox-LDL组(用含50μg/ml,100μg/m1,200μ/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24 h);时效实验:随机将培养的6孔板细胞分为8组:不同时间的对照组(不加任何干预因素,用培养基培养内皮细胞0,12,24,48 h)和ox-LDL组(用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞0,12,24,48小时),检测内皮细胞凋亡和VPO1蛋白表达;
(2)研究VPO1基因沉默后对ox-LDL诱导的内皮细胞活性氧、HOCl及p38MAPK蛋白的影响。分组如下:随机将培养的6孔板细胞分为6组:空白对照组:用含1％小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时;ox-LDL组:用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时;+apocynin组:加入终浓度为600μM的apocynin(NADPH酶的特异性阻断剂)孵育细胞1 h后,加入100μg/mlox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时;+VPO1 sh RNA组:在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时;VPO1sh RNA组:在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含1％小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时;apocynin组:加入终浓度为600μM的apocynin(NADPH酶的特异性阻断剂)孵育细胞1 h后,用含1％小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时;采用比色法检测活性氧,采用荧光法测定HOCl,采用Western-blot法检测NADPH gp91phox,p38MAPK和VPO1蛋白表达
(3)研究VPO1基因沉默后对ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡和caspase-3活性的影响。分组如下:随机将培养的6孔板细胞分为8组:空白对照组:用含1％小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时;ox-LDL组:用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时;+apocynin组:加入终浓度为600μM的apocynin(NADPH酶的特异性阻断剂)孵育细胞1 h后,加入100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时;+VPO1 sh RNA组:在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型巾,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时;+SB203580组:加入终浓度为1μM的SB203580(p38MAPKs的特异性阻断剂)孵育细胞1 h后,加入100μg/mlox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时;+DEVD-CHO组:加入终浓度为100μM的DEVD-CHO(caspase-3的特异性阻断剂)孵育细胞1 h后,加入100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时;VPO1 sh RNA组:在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含1％小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时;apocynin组:加入终浓度为600μM的apocynin(NADPH酶的特异性阻断剂)孵育细胞1 h后,用含1％小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时;采用比色法检测细胞内caspase-3活性,采用流式细胞仪检测内皮绌胞凋亡。
结果:
(1)ox-LDL呈浓度和时间依赖性地增加Hoechst阳性细胞数,增加内皮细胞凋亡率(P＜0.01),促进内皮细胞VPO1蛋白表达。
(2)与对照组相比,ox-LDL(100μg/ml)培养内皮细胞24 h显著升高内皮细胞内ROS水平(P＜O.01),VPO1基因沉默后或加入NADPH氧化酶抑制剂apocynin(600μM)预处理1h后,可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞ROS生成、NADPH gp91phox、VPO1、p38MAPK蛋白表达及HOCl生成。
(3)与对照组相比,ox-LDL(100μg/ml)培养内皮细胞24 h显著增加内皮细胞凋亡率(P＜0.01),VPO1基因沉默,加入NADPH氧化酶抑制剂apocynin(600μM),SB203580(1μM),或DEVD-CHO(100μM)预处理1h后,可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞的凋亡和caspase-3活性升高(P＜0.01)。
结论:
(1)首次证实ox-LDL可呈浓度和时间依赖性地增加内皮细胞VPO1表达;
(2)成功构建VPO1基因沉默的内皮细胞模型,并首次发现VPO1基因沉默后可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡,其机制与抑制NADPH gp91 phox蛋白表达,从而抑制ROS/p38MAPKs/caspase-3通路有关。