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本课题组前期工作从来源于水牛瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶C5614-1中鉴定了一个新的碳水化合物结合组件(CBM),命名为CBMC5614-1,与其它已知的CBM没有同源性,它位于该蛋白的C末端,长度为189个氨基酸,该CBM的特点是能结合广泛的多糖。首先构建了编码不同长度的缺失N端或C端的CBMC5614-1的重组质粒,并表达和纯化了缺失多肽。通过缺失多肽与多糖底物的结合能力的检测确定了 CBMC5614-1的第16-149aa是具有结合功能的最短区域。根据CBMC5614-1最短的功能区段,在GenBank数据库中搜寻到15个同源多肽,进化树分析表明该16个同源多肽分为两个明显的分支,分支内多肽之间氨基酸的一致性在25%以上,分支间的一致性在20%以下,虽然两个分支间的同源性低,但是与其他家族的CBM(如CBM37)比较,它们还是在一个大分支上,说明它们之间还是具有亲缘关系的,也表明这些同源多肽形成两个亚家族。其中亚家族a中包括CBMC5614-(亚家族a的代表成员)、ADR64668-1、CAJ19146、ADR64668-2、ADR64664 和 AEK98797;亚家族b中包括CBMC35-2(亚家族b的代表成员)、CBMC29-2、CBMC67-1、ADR64666、ADR64663、ABX76045、ADK55024、AAC36862、ABB46200和 ADA62505。选取CBMC5614-1的7个具有代表性的同源多肽的编码序列进行克隆重组并表达及纯化了表达产物,其中亚家族a中选了 2个(ADR64668-1和CAJ19146)和亚家族 b 中选择了 5 个(C35-2、C29-2、C67-1、AAC36862和ABB46200)。对同源多肽进行多糖底物的结合能力检测,结果显示除ABB46200外,它们具有与CBMC5614-1相同的多糖结合谱,确定这些同源多肽均为CBM。ABB46200与其他同源多肽相比,结合多糖底物谱窄一点,而且与多糖的结合能力比其他同源多肽也较弱。文献报道已经证实芳香族氨基酸在CBM识别和结合多糖底物中起重要作用。通过同源多肽之间的多序列比对,发现所有的同源序列中有3个保守的芳香族氨基酸,分别W17、Y48和H117(编号以CBMC5614-1为准);亚家族a中有12个保守的芳香族氨基酸(F9、W17、Y41、F45、Y48、F53、Y55、W60、F74、F99、Y104)以及一个保守的杂环族氨基酸(H117)(编号以CBMC5614-1为准);亚家族b中有11个保守的芳香族氨基酸(Y7、Y11、W15、F19、F21、Y34、Y45、Y54、Y73、F87、W133,编号以 CBMC35-2为准)。用重组PCR的方法分别对各亚家族代表成员(CBMC5614-1和CBMC35-2)的保守的芳香族的氨基酸均定点突变成丙氨酸,进行了各定点突变多肽对各种多糖底物结合能力的定性检测。结果显示,在CBMC5614-1的突变体在对可溶性底物进行结合时,W17A和W60A对多糖的结合能力完全失去,Y48A、F45A、F74A和H117A的结合能力有一定的下降;CBMC5614-1的突变体对不可溶性底物进行结合时,W17A、W60A和Y48A的结合能力大幅度的下降,F45A、F74A和H117A的结合能力也有一定的下降趋势。在CBMC35-2突变体在对可溶性底物结合检测中发现,W133A的结合能力几乎完全失去,Y11A、W15A、F19A的结合能力大幅度下降,F21A、Y34A、Y54A、F73A结合能力均稍微减弱;但CBMC35-2的突变体多肽对不可溶性多糖的结合能力都没有明显改变。上述研究表明,CBMC5614-1的同源多肽均为CBM以及它们的3个保守的芳香族氨基酸W17、Y48和H117(编码以CBMC5614-1为准)突变后对多糖底物的结合能力均有影响,可以证明CBMC5614-1及其同源多肽为一个新家族 CBM。