目的:半夏和生姜是《金匮要略》中的常用药对,二者配伍即小半夏汤,随证候不同,半夏与生姜的用量、比例、煎煮方法、服用方法等均有所不同。半夏生姜药对常用于各种原因导致的呕吐,尤其对肿瘤化疗引起的恶心呕吐具有确切疗效。已有大量研究显示,单味药半夏、生姜以及其中所含的多种活性成分均具有抗肿瘤作用,但两味配伍的抗肿瘤作用研究较少。因此,在前期小半夏汤抗化疗呕吐的工作基础上,本研究提出以下假设:1、半夏生姜配伍具有一定的抑制肿瘤生长作用;2、半夏生姜配伍抗肿瘤生长具有一定的协同作用。本研究首先对半夏生姜药对进行了文献梳理,并采用SKOV3卵巢癌细胞株,运用网络药理学筛选、细胞生物学和分子生物学等实验技术,对半夏生姜配伍抗肿瘤作用机制进行了较深入观察。方法:1.文献研究:利用Pub Med、中国知网、万方、维普、中国生物医学数据库,以“半夏”、“生姜”、“Pinellia”、“ginger”、“antitumor”等检索词,根据不同数据库制定检索策略,将收集到的文献进行筛选,总结半夏生姜及其活性成分的抗肿瘤特性以及对哪些肿瘤具有潜在的抗肿瘤作用,通过MTT方法检测对肿瘤的抑制作用。2.半夏生姜协同抗卵巢癌增殖和促凋亡研究:为探索半夏生姜如何配伍其抗肿瘤作用最显著,首先针对半夏生姜不同配伍方式制备小半夏汤（经方、现代）、生姜半夏汤、半夏干姜散（清水、浆水）以及半夏和生姜的含药血清,通过CCK8方法观察不同配伍方式抑制卵巢癌细胞增殖的能力,利用流式细胞技术观察其诱导细胞凋亡的作用,通过WB技术观察半夏生姜配伍对卵巢癌SKOV3细胞Bcl-2、Bax、Caspase-8,Caspase-9,Caspase-12,Caspase-3基因表达的影响,观察不同半夏生姜配伍方式诱导SKOV3细胞凋亡作用。制备半夏、生姜冻干粉,通过CCK8方法计算半夏生姜抗SKOV3细胞增殖的IC50值。根据获取的半夏IC50值与不同剂量生姜配伍,然后根据获取的生姜50%抑制浓度（IC50值）与不同剂量半夏配伍,CCK8法检测不同配伍条件下对SKOV3细胞的抑制作用。利用Compu Syn分析软件,计算半夏生姜配伍抗SKOV3细胞增殖的组合指数（CI）、抑制效应系数（Fa）、剂量-约化指数（DRI）,探索不同抑制效应时半夏、生姜的剂量和配伍比例。按照获得的Fa为0.5时半夏生姜用量和比例和单纯半夏、生姜的IC50值进行比较,利用流式细胞技术和WB技术观察在半抑制条件下,单纯使用半夏、生姜和半夏生姜配伍对诱导细胞凋亡的影响。选择合适的比例用于卵巢癌裸鼠模型,观察其在体抑瘤作用。3.网络药理学分析和分子对接:利用TCMSP数据库,按照口服利用度（OB）≥30%,类药性（DL）≥0.18获取半夏、生姜主要活性成分,并获得相关活性成分mol2格式,将相关活性成分mol2格式上传Pharm Mapper数据库,获得半夏生姜相关作用靶点。利用Dis Ge NET和OMIM数据库,搜集卵巢癌相关疾病靶点。通过两者交集获得半夏生姜作用于卵巢癌的潜在靶点,将共有靶点上传STRING数据库进行蛋白质相互作用分析,使用Cytoscape软件构建“中药-成分-靶点”网络。利用KOBAS数据库进行GO分析和KEGG分析。通过相关信号途径分析,选择可能的信号通路及潜在的作用靶点。将相关活性成分mol2格式用Py MOL软件进行处理,得到相关pdb格式。利用autodock进行分子对接,选择其中结合能最高的结合方式,分析其结合特点。4.实验验证:利用SKOV3细胞株、采用免疫荧光技术检测半夏、干姜配伍对细胞内脂质过氧化物和铁离子的影响。通过酶联免疫标记技术检测细胞内谷胱甘肽含量,利用O2K技术检测细胞线粒体氧化磷酸化过程及复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的功能,通过WB方法检测PI3K/AKT/m TOR及相关靶点表达情况,对网络药理研究结果进行实验验证。结果:1.半夏生姜配伍在现代临床多以降逆止呕为主,尽管抗肿瘤治疗的研究较少,但从“化痰散结”角度进行抗肿瘤研究也完全符合中医的理论。而且半夏和生姜活性成分对肿瘤的影响也有广泛的研究。其中,半夏中的生物碱、蛋白质、多糖类物质、环二肽类物质、挥发油等成分均表现出抗肿瘤活性;生姜中的挥发油、姜油树脂等成分抗肿瘤活性相对较明显。从肿瘤类型来看,半夏生姜对结直肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌等均有抑制作用。通过MTT检测对SKOV3细胞、Hela细胞、A549细胞、Caco-2细胞进行检测,发现半夏生姜对SKOV3细胞的抑制作用最明显（P＜0.05）。2.CCK8检测半夏生姜配伍组和半夏、生姜组均可对SKOV3细胞增殖能力具有抑制作用,而且半夏生姜配伍组的抑制作用更明显。流式细胞技术显示半夏生姜配伍诱导细胞凋亡的作用更明显（P＜0.05）。WB检测显示半夏、生姜及配伍组在不同程度上对Bcl-2、Caspase-3,8,9均有一定的抑制作用（P＜0.05）。CCK8检测半夏、生姜冻干粉对SKOV3的IC50值分别为125.3±15.4μg/m L（24h）、95.15±9.63μg/m L（24h）。通过Compu Syn分析显示:按照IC50值获得的半夏用量与不同浓度生姜配伍时具有明显的协同促SKOV3细胞凋亡的作用,但按照IC50值获得的生姜用量与不同浓度半夏配伍时并没有表现出协同作用。不同抑制效应系数下,半夏生姜的比例是不同的,在抑制效应系数为0.5时,半夏、生姜的用量为83.5ug/ml、85.9ug/ml。接近1∶1的比例。流式细胞技术和WB显示半夏生姜配伍比单用半夏和生姜在抑制SKOV3增殖和促进细胞凋亡方面的作用更显著。3.利用TCMSP数据库,按照OB≥30%,DL≥0.18的标准共获得半夏活性成分13个,生姜活性成分5个,其中豆甾醇和β-谷甾醇是二者共有的成分,因此共获得16个活性成分,靶点360个,利用Dis Ge NET和OMIM数据库,获得卵巢癌相关基因2930个。韦恩图显示半夏生姜作用于卵巢癌相关基因99个。KEGG分析结果显示“pathways in cancer”、“PI3K/AKT/m TOR”是最重要的信号途径。而“pathways in cancer”途径中的相关靶点与PI3K/AKT/m TOR也有密切关系,另外与氧化应激关系也比较密切。对其中相关靶点进行分子对接,显示多种成分均可与相关靶点结合,其结合位点差异较大,从而产生协同或拮抗的作用。4.免疫荧光显示,半夏生姜可明显促进SKOV3细胞中ROS表达（P＜0.05）,同时细胞内铁离子含量明显升高（P＜0.05）,GSH/GSSG比例明显降低（P＜0.05）。细胞氧化磷酸化过程分析显示半夏生姜对复合体Ⅰ、Ⅱ的抑制作用较明显（P＜0.05）,这也是自由基产生的高发位点。同时NQO1、GSTP1表达明显减少（P＜0.05）。对PI3K/AKT/m TOR的WB分析显示,半夏生姜可抑制AKT和m TOR的磷酸化程度。（P＜0.05）。结论:生姜在半夏抗卵巢癌SKOV3细胞增殖及诱导凋亡过程中具有协同促进作用,但两者并无固定的配伍比例,在Fa=0.5时,两者比例为1∶1。其协同抗卵巢癌SKOV3的机制可能与诱导ROS生成、铁死亡和抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路有关。