论文部分内容阅读
研究背景子宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤中最常见的恶性肿瘤，严重威胁着女性的健康和生命。全世界每年大约有50万新发子宫颈癌病例，约23万女性死于子宫颈癌，其中大部分（80%左右）发生在发展中国家。其中发病率最高的是南非，其次是亚洲。我国每年新发病例约13万例，占全世界的近1/4。子宫颈癌的病因迄今未完全明确。分子生物学研究表明90%以上的子宫颈癌伴有高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染，主要是16、18亚型。高危型HPV持续感染在子宫颈癌的发生和发展中起着至关重要的作用，70%以上的子宫颈癌组织中存在HR-HPV基因组的整合。目前的研究证实，高危型HPV16和18型的早期基因E6、E7编码的早期蛋白E6、E7在宫颈上皮细胞恶化过程中发挥关键作用。E6、E7蛋白分别于P53和Rb结合，使P53和Rb降解，最终导致子宫颈癌的发生。E6蛋白的致癌作用主要表现在招募E6AP（E6-associated protein）形成复合体后与P53核心区结合，促进P53通过泛素蛋白酶体降解途径降解。E6AP是泛素连接酶（ubiquitin-ligaseenzyme，E3）的HECT结构域家族成员。HPV E6蛋白与E6AP结合后将活化的泛素转移到P53蛋白上，最终P53蛋白在26S蛋白酶体的作用下沿泛素化降解途径降解。在子宫颈癌的发生和发展中，E6对P53的抑制和降解作用起着关键作用。GRIMs (genes associated with retinoid-IFN-inducedmortality)是近年来发现的一群参与干扰素(interferon, IFN)和维甲酸(retinoic acid, RA)合并诱导的细胞凋亡基因，是Kalvakolanu用反义RNA敲除技术在乳腺癌细胞中筛选鉴定并首先报道的凋亡蛋白。GRIM-19属GRIMs家族成员，定位于19p13.2，是参与细胞线粒体的呼吸作用和调控细胞凋亡的新基因。GRIM-19主要定位在线粒体，细胞核也有少量表达，在人体多种正常组织中均有其表达。研究发现GRIM-19的表达促进了细胞的凋亡，其表达降低或位点突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化。许多肿瘤中，如甲状腺肿瘤、口腔癌、肾癌、结直肠癌等中均发现GRIM-19表达的降低。但GRIM-19在子宫颈癌细胞发生、发展中所发挥的具体作用尚不明晰。本课题组前期试验已证实在子宫颈癌细胞株HeLa、SiHa和CaSki细胞中均发现GRIM-19可以上调p53及其下游基因p21、PUMA的表达，而HPV阴性的卵巢癌细胞株H08910细胞中却并未发现该现象。GRIM-19具有诱导子宫颈癌细胞中P53蛋白积聚的重要作用且积聚的P53蛋白具有抑制子宫颈癌细胞增殖的功能。而且证实GRIM-19诱导子宫颈癌细胞中P53蛋白的积聚作用既不是直接作用也不是通过抑制STAT3而间接促进P53基因的转录、翻译，而是通过抑制子宫颈癌细胞中P53蛋白的降解，延长其半衰期来达到诱导P53蛋白积聚的作用。子宫颈癌细胞中P53蛋白的降解是通过E6和E6AP的共同作用来实现的。本实验组前期以HPV18E6为研究对象，进一步研究了子宫颈癌细胞中GRIM-19与HPV18E6的相互作用，结果显示：GRIM-19与18E6具有蛋白结合作用，而与p53没有蛋白结合作用；GRIM-19诱导HR-HPV感染的子宫颈癌细胞中p53蛋白积聚的作用机制是通过与E6蛋白结合，阻碍E6介导的p53泛素化降解途径；E6AP具有竞争18E6结合GRIM-19的作用。本实验将以HPV16E6、HPV18E6为研究对象，进一步探讨子宫颈癌细胞中GRIM-19与HPV16E6、HPV18E6的相互作用及其作用位点。目的研究子宫颈癌细胞中GRIM-19与HPV16E6、HPV18E6的相互作用及其作用位点的研究，为子宫颈癌的生物治疗提供新的理论依据和治疗线索。方法（1）构建GRIM-19， HPV16E6原核表达载体： pGST-G19①[pGEX-4T-3-GRIM-19（1-35）]、pGST-G19②[pGEX-4T-3-GRIM-19（36-70）]、pGST-G19③[pGEX-4T-3-GRIM-19（71-144）]、 pET-flag-16E6（pET-22b-3×flag-16E6），16E6真核表达质粒：p3×Flag-16E6(p3×Flag-CMV-Myc-24-16E6)；（2）采用免疫共沉淀方法（CO-IP）检测GRIM-19与16E6蛋白的体内结合作用；（3）诱导融合蛋白在大肠杆菌中表达与纯化；（4）采用GST pull down方法检测GRIM-19与16E6、18E6蛋白的体外结合作用；（5）采用GST pull down方法检测GRIM-19与E6AP蛋白的体外结合作用。结果（1）CO-IP方法检测结果显示在宫颈癌细胞株SiHa细胞中GRIM-19与16E6在体内具有蛋白结合作用（2）GST pull down方法检测结果显示GRIM-19①与HPV16E6在体外具有蛋白结合作用；（3）GST pull down方法检测结果显示GRIM-19①与HPV18E6在体外具有蛋白结合作用；（4）GST pull down方法检测结果显示GRIM-19与E6AP①在体外具没有蛋白结合作用；（5）GST pull down方法检测结果显示GRIM-19与E6AP②在体外具没有蛋白结合作用（；6）GST pulldown方法检测结果显示GRIM-19与E6AP③在体外具有蛋白结合作用；（7）GSTpull down方法检测结果显示GRIM-19①与E6AP③在体外具有蛋白结合作用。结论GRIM-19与HPV16E6、HPV18E6均有结合作用且GRIM-19的结合位点均为第1-35位氨基酸；GRIM-19与E6AP在体外有结合作用，GRIM-19的结合位点为第1-35位氨基酸，E6AP的结合位点为第521-872位氨基酸即HECT结构域。