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为了建立昆明小鼠胚胎冷冻经济、有效、稳定的方案,本研究以该品系小鼠体内受精胚胎(原核胚)为试验材料,从胚胎回收、冷冻载体、冷冻保护剂等环节出发,探讨了昆明小鼠体内受精原核期胚胎经历玻璃化冷冻保存后的发育能力。论文包括五个试验,具体研究结果如下:(1)研究了体重、激素注射量对昆明小鼠超排效果的影响。结果显示:①体重<20g时,供体小鼠的超排效率显著低于体重在20～31g的昆明小鼠(P<0.05);②使用5IU PMSG/hCG,超排效率不如10IU PMSG/hCG。(2)研究了开放式拉长细管法(Open pulled straws,OPS)与冷冻帽(Cryotop)两种载体对小鼠原核期胚胎发育的影响。结果显示:OPS组和Cryotop组解冻后胚胎的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率分别为84.28% vs 74.10%、57.35% vs 65.87%、28.34% vs 43.57%与对照组(81.19%、64.25%、40.04%)差异不显著(P>0.05),但Cryotop冷冻结果更接近对照组,效果较佳。(3)研究了Cryotop与自制Cryotip载体对小鼠原核期胚胎发育效果的影响。结果发现我们自制的Cryotip玻璃化冷冻载体与成品载体冷冻解冻昆明小鼠原核期胚胎,经体外培养,胚胎2-细胞率、4-细胞率、桑椹胚率和囊胚率差异都不显著(P>0.05),但从数值上看,在自制Cryotip载体冷冻结果中,除了2-细胞发育率外,其他几项结果都稍微高于成品组:桑椹胚与囊胚率分别为63.84%、58.48%(自制Cryotip组为66.29%、62.72%)。可见,自制载体冷冻效果不比成品冷冻效果差。(4)研究了不同冷冻保护剂:15% EG+15% DMSO+蔗糖(EDS)与15% EG+15% PROH+蔗糖(EPS)对小鼠原核期胚胎发育效果的影响,结果发现:①采用EPS与EDS两种保护剂所获得的胚胎回收率与存活率96.35%、84.83%(94.95%、95.83%)无显著差异(P>0.05);②冷冻解冻后胚胎2-细胞发育率60%、70%与对照组(92.50%)差异显著(P<0.05),但冷冻组间无差异(P>0.05);③在囊胚发育率中,采用EDS组与对照组无显著差异(56.35% vs 76.90%)(P>0.05),但EPS组与对照组(33.84% vs 76.90%)以及冷冻组之间(33.84% vs 56.35%)差异显著(P<0.05);④EDS组囊胚平均细胞数与EPS、对照组相比较差异显著(P<0.05)。结果可见采用EDS作冷冻保护剂对昆明小鼠原核期胚胎冷冻效果好于EPS方法。(5)除了渗透性冷冻保护剂对冷冻效果有影响,渗透性保护剂与有很大的作用,本试验以EG、DMSO为渗透性保护剂,研究了蔗糖与海藻糖对胚胎冷冻效果的影响,以及不同的胚胎体外培养密度:5枚/10μl、10枚/40μl、5枚/40μl(即构成1:2、1:4、1:8密度大小)对胚胎发育的影响。结果显示采用蔗糖与海藻糖两种保护剂所获得的胚胎2-细胞率、4-细胞率、桑椹胚率与囊胚率(70% vs 67.5%;69.04% vs 72.44%;57.22% vs 58.75%;54.05% vs 53.83%)上均无显著差异(P>0.05),而且数值差别非常的小,说明蔗糖与海藻糖都能很好地作为昆明小鼠原核期胚胎冷冻保护剂,而且效果好;解冻后胚胎在1:2、1:4、1:8密度大小的KSOM-AA培养液中培养所获得的胚胎2-细胞率、4-细胞率、桑椹胚率以及囊胚率无显著差异(P>0.05)。综上所述,本研究成功建立了昆明小鼠原核期胚胎有效、经济、稳定的冷冻解冻及体外培养技术体系,即选用Cryotop作玻璃化冷冻载体,使用EG+DMSO+蔗糖或者海藻糖冷冻保护剂,在选择供体小鼠时,昆明小鼠体重最好大于20g,并使用10 IU PMSG/hCG剂量的激素。