【摘 要】
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胶原蛋白是动物细胞外基质(ECM)的重要组成部分,其在细胞的生长、迁移以及组织的形成、功能中发挥着重要作用,被认为是一种可广泛应用于组织工程、细胞工程,的生物材料。近年来,由于人畜共患疾病的频发以及宗教原因,传统陆源动物胶原蛋白的生产和应用受到限制,水生生物来源的胶原蛋白引起了人们的广泛关注。中国是水产大国,在水产品加工过程中会产生大量的鱼头、鱼皮、鱼骨等下脚料,造成了巨大的资源浪费和环境污染。其
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胶原蛋白是动物细胞外基质(ECM)的重要组成部分,其在细胞的生长、迁移以及组织的形成、功能中发挥着重要作用,被认为是一种可广泛应用于组织工程、细胞工程,的生物材料。近年来,由于人畜共患疾病的频发以及宗教原因,传统陆源动物胶原蛋白的生产和应用受到限制,水生生物来源的胶原蛋白引起了人们的广泛关注。中国是水产大国,在水产品加工过程中会产生大量的鱼头、鱼皮、鱼骨等下脚料,造成了巨大的资源浪费和环境污染。其中,我国主产的罗非鱼鱼皮中,80%的蛋白质为胶原蛋白。因此,利用罗非鱼等水产品加工下脚料提取胶原蛋白,并开发高效胶原蛋白基水凝胶用于创伤的修复,对于人民健康及水生生物资源利用都具有重要意义。本论文针对以上问题,主要开展工作如下:(1)从罗非鱼鱼皮中成功提取了酸溶胶原蛋白(ASC)和胃蛋白酶溶胶原蛋白(PSC)。蛋白凝胶电泳结果显示ASC和PSC的分子组成均为(α1)2α2,属于I型胶原蛋白。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析和圆二色谱(CD)分析证实了胶原蛋白三螺旋结构的完整性。差示扫描量热法(DSC)和Zeta电位实验表明,ASC和PSC的热稳定温度分别为51.59℃和50.57℃,等电点分别为5.40和5.75。细胞毒性实验证实ASC和PSC均能促进NIH-3T3成纤维细胞增殖,且PSC的效果优于ASC。由于PSC的优良性能,本论文后期实验将利用PSC制备胶原基水凝胶进行性能表征及创伤愈合效果评价。(2)利用胶原蛋白的自聚集特性,制备了四种不同PSC浓度的水凝胶(PSC 5、PSC 10、PSC 15和PSC 20),并探究其在难愈创面方面的应用。弥散实验中四种水凝胶在伤口模拟液中均未弥散。含水量和保水率实验表明,四种水凝胶的含水量均在98%以上,其保水率随PSC浓度的增加而显著提高。流变学实验表明水凝胶的机械强度随PSC含量的增加而增强,但G’/G’’值没有显著变化,说明其结构变化仅是由密度的增加引起。扫描电子显微镜(SEM)结果表明除PSC 5水凝胶由于机械强度较低、内部结构混乱无序外,其他3种水凝胶均具有规则的网络结构。细胞毒性实验证实,所制备的水凝胶对成纤维细胞均无明显毒性。大鼠皮肤深二度烫伤修复实验表明,PSC 10水凝胶处理的伤口愈合速度更快,创面组织切片表明PSC 10水凝胶处理后加速了创面表皮层形成和皮肤附件的产生。该实验证实了胶原蛋白水凝胶在伤口敷料方面的潜在应用价值。(3)在胶原含量较低的PSC 5水凝胶中复配不同浓度的海藻酸钠(SA)构建胶原基复合水凝胶。弥散实验表明胶原-海藻酸盐水凝胶在伤口模拟液中均未弥散。含水量和保水率实验表明,复配水凝胶含水量高达98%,其保水率随SA浓度的增加显著增强。流变学实验表明,胶原-海藻酸盐水凝胶的机械强度随SA浓度的提高而显著增强,并且引入海藻酸盐网络后水凝胶内部结构发生了明显变化。降解实验显示SA浓度10 mg/m L以上的胶原-海藻酸盐水凝胶可将胶原蛋白降解时间延长至12 h以上。细胞毒性实验表明,胶原-海藻酸盐水凝胶无明显毒副作用。大鼠皮肤深二度烫伤修复实验证实胶原-海藻酸盐水凝胶的治愈效果优于纯胶原水凝胶,伤口愈合速度明显较快。创面免疫组化分析表明,胶原-海藻酸盐水凝胶处理的创面同期具有更多的血管内皮生长因子(VEGF)存在,说明SA的引入提高了胶原蛋白水凝胶的性能,增强了其在创面修复的治疗效果。本论文中水产来源胶原蛋白及其水凝胶的制备为水产加工下脚料的综合利用提供了新途径和新思路,也为水产胶原基水凝胶在烧烫伤修复方面实际应用奠定了良好的前期工作基础。
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