【摘 要】
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漆酶(苯二醇∶氧氧化还原酶,EC l.10.3.2)为一类含铜的多酚氧化酶,因其能够催化氧化多种酚类和非酚类化合物,在食品、医药、造纸、环境等方面都有广泛的应用。但漆酶的表达水平较低、生产成本较高,限制了其大规模生产和应用。添加诱导剂是提高漆酶产量的有效手段之一,而高效无毒的诱导剂的开发是关键。本论文采用螯合铜离子的三肽-蓝铜胜肽(GHK-Cu)为诱导剂,以变色栓菌液态发酵为研究对象,优化GHK-
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漆酶(苯二醇∶氧氧化还原酶,EC l.10.3.2)为一类含铜的多酚氧化酶,因其能够催化氧化多种酚类和非酚类化合物,在食品、医药、造纸、环境等方面都有广泛的应用。但漆酶的表达水平较低、生产成本较高,限制了其大规模生产和应用。添加诱导剂是提高漆酶产量的有效手段之一,而高效无毒的诱导剂的开发是关键。本论文采用螯合铜离子的三肽-蓝铜胜肽(GHK-Cu)为诱导剂,以变色栓菌液态发酵为研究对象,优化GHK-Cu诱导漆酶发酵的培养基组分;研究GHK-Cu高效诱导漆酶合成的机制;借助转录组学方法探索GHK-Cu对变色栓菌漆酶合成相关基因表达的调控。本论文主要结论如下:(1)通过对GHK-Cu诱导的变色栓菌液态发酵培养基组分的单因素和响应面优化,获得最佳培养基配方为:GHK-Cu 290μM,葡萄糖4.21 g/L,NH4Cl 0.31g/L,KH2PO4 0.18 g/L,Ca Cl2 0.047 g/L,FeSO4.7H2O 0.043 g/L,MgSO4.7H2O 0.05g/L;模型的最大响应值为830.233 U/L。在最优发酵培养基条件下,变色栓菌的实际发酵酶活为850.05 U/L,与未添加诱导剂的优化发酵培养基中的发酵漆酶活力(66.56 U/L)相比,漆酶产量提高了12.77倍。将最优发酵培养基用于5 L搅拌反应器的变色栓菌放大培养,5天后最大酶活达到1113.57 U/L,为摇瓶培养的1.31倍。GHK-Cu可高效诱导变色栓菌液体发酵产漆酶,该策略可用于漆酶的反应器放大生产。(2)在相同诱导剂浓度下(290μM),GHK-Cu组的漆酶产量较CuSO4组提高了92.5%,GHK-Cu中Cu2+存在形式是提高其诱导效果的主要原因之一。与不加诱导剂的对照组相比,含Cu2+诱导剂的加入使变色栓菌菌体细胞膜透性增强,细胞壁厚度减小,且GHK-Cu对细胞膜和细胞壁的损害要弱于CuSO4。GHK-Cu组胞外Cu的最大消耗速率和胞内Cu的累积速率分别为0.35 mg/L/h和0.11mg/g/h,大于CuSO4组的0.15 mg/L/h和0.06 mg/g/h,以蓝铜胜肽作为Cu2+来源,更有利于变色栓菌对Cu2+的吸收与利用。液体培养第6天时,GHK-Cu组Tv Lac2基因的表达量相对于对照组提高了28.15倍,而CuSO4组则提高了14.88倍;Tv Lac3和Tv Lac4在第5天达到峰值,诱导剂组基因表达量较对照组大幅提高且GHK-Cu组基因表达量高于CuSO4组,表明GHK-Cu能够促进漆酶基因的表达,且GHK-Cu比CuSO4更具优势。(3)由变色栓菌转录组学分析结果可知,诱导剂组相对于对照组的总差异基因在第5天最为显著,其中GHK-Cu总差异基因有5573个,CuSO4组总差异基因有3794个。KEGG富集分析表明,诱导剂组上调基因中显著富集路径大部分集中在氨基酸的代谢与合成;而其下调基因中显著富集路径均包括与次生代谢产物合成有关的途径。与CuSO4组不同,GHK-Cu的加入上调了DNA合成、核糖体合成以及大量RNA转运、m RNA监视通路的相关基因,这可能与GHK-Cu促进漆酶合成密切相关。诱导剂组中与金属离子运输与转移蛋白相关基因的表达水平显著上调,且GHK-Cu组的相关基因上调水平明显高于CuSO4组。通道蛋白基因(19411270、19416261)和金属结合域基因(119411942)在GHK-Cu组出现显著上调,而在CuSO4组未见变化。由GO功能富集分析可知,诱导剂组中上调基因显著富集的功能中均存在GO:0005507-copper ion binding,且GHK-Cu组对相关基因表达的促进效果更加显著;而诱导剂组下调基因中均有显著富集的功能基因包括与细胞膜和细胞壁合成相关的基因GO:0031224-intrinsic component of membrane,GO:0016021-integral component of membrane,GO:0005618-cell wall和GO:0009277-fungal-type cell wall,表明Cu2+诱导剂的添加会对变色栓菌细胞壁合成以及细胞膜完整性产生不利影响。在发酵培养过程中,漆酶基因Tv Lac1~Tv Lac7都会受到GHK-Cu的诱导作用,其表达水平显著提高,而CuSO4对部分漆酶基因表达无显著上调作用,进一步说明GHK-Cu是变色栓菌漆酶合成的高效诱导剂。
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