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高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS）,又称高致病性猪蓝耳病,被世界动物卫生组织（OIE）规定为必须报告的动物疫病,其致病因子为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV）。自2006年我国首次爆发HP-PRRS后,十多年来该病已经给我国养猪业造成了巨大的经济损失。HP-PRRS主要是以各阶段猪群的呼吸系统疾病以及妊娠母猪早产、流产、死胎等繁殖障碍为特征,并且造成较高的死亡率。近年来,随着HP-PRRS防控手段的多元化,疫病态势趋于良好,但仍存在散毒范围较广、毒株变异等问题,防控形势依然严峻。《国家高致病性猪蓝耳病防治指导意见（2017—2020年）》中指出,坚持以预防为主仍是当前的防控原则。进一步开发研制安全有效的HP-PRRS疫苗将有利于从源头控制疫病发生,有助于最终实现净化目标。病毒载体疫苗因兼备载体病毒和外源蛋白的免疫优势已成为当前HP-PRRS疫苗研发的热点,具有广阔的应用前景和价值。为此,本文开展了HP-PRRS重组新城疫病毒载体疫苗的构建与免疫原性评价及其佐剂实验研究。1. HP-PRRS重组新城疫病毒候选疫苗的构建及鉴定新城疫病毒（Newcastle virus,NDV）是一种应用范围广泛的优质疫苗载体。本研究首先通过RT-PCR扩增HP-PRRSV GD株的主要结构蛋白基因ORF3和ORF5片段。基于NDV La Sota株反向遗传平台,通过同源重组技术分别将ORF3-double、IRES、ORF5-double和ORF5-single等外源片段克隆至NDV载体中,构建两种重组NDV感染性克隆。通过磷酸钙转染法,将重组质粒连同三种辅助质粒p BS-NP、p BS-P和p BS-L共同转染BSR细胞。将收获的细胞培养液接种9日龄SPF鸡胚进行病毒拯救,通过血凝实验判定病毒拯救效率。利用IFA和Western Blot判定重组病毒外源蛋白表达情况,测定NDV MDT、ICPI和IVPI等毒力学评价指标判定重组病毒的毒力水平。质粒鉴定结果显示成功构建得到重组质粒p BRN-FL-ORF5和p BRN-FL-ORF3-IRES-ORF5;血凝实验结果显示成功拯救出两株重组病毒r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5,且重组病毒在接种鸡胚后72 h时均可达到滴度峰值(8.7 log EID50/m L);RT-PCR结果显示外源片段均成功插入到NDV载体基因组内,且具有良好的鸡胚遗传稳定性;IFA和Western blot结果显示两株重组病毒均有效表达外源蛋白。根据OIE对NDV毒力的评价标准,两株重组病毒均属弱毒株,同母本毒一致。本实验结果表明成功构建并拯救得到两株重组病毒r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5,其可作为候选疫苗进行后续动物免疫原性及安全性评价实验研究。2. 重组NDV候选疫苗小鼠致病性及免疫效果评价本实验以小鼠作为动物模型评价两种重组候选疫苗r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5在小鼠体内的致病性和免疫效果。分别将两种重组候选疫苗以肌肉注射和颅内注射的方式接种小鼠,连续两周测定体重变化。在接种后第14天采集各组小鼠主要器官组织,利用RT-PCR方法检测病毒残留。以肌肉注射的方式免疫小鼠,分别在体液和细胞水平评价免疫效果。致病性实验结果显示重组病毒以肌肉和颅内注射方式接种小鼠后,小鼠体重变化趋势均与PBS对照组相近;RT-PCR结果显示小鼠各主要器官组织内均未检测到病毒残留。免疫原性评价结果显示与r La Sota-GP5（滴度:9.10±1.91）相比,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可刺激小鼠产生更高水平的特异性中和抗体（滴度:12.64±4.15）,可显著刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖。本实验结果表明两株重组病毒接种小鼠均未显著引起体重异常变化且无组织病毒残留,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可刺激小鼠产生更高水平的体液和细胞免疫反应。3. 重组NDV候选疫苗猪体内安全性评价本实验分别从基因水平、蛋白水平、病毒外排和临床状态等四个方面对所构建的两种重组NDV候选疫苗r La Sota-GP5与r La Sota-GP3-GP5进行猪体内免疫安全性评价。采集猪主要器官组织、血液、排泄物等样品,利用q RT-PCR检测重组疫苗在猪体内复制周期和病毒排出情况;通过免疫组化检测主要器官组织中的蛋白表达情况;观察免疫猪的生长活动状态,通过主要组织病理切片判定是否导致病变。结果显示重组候选疫苗免疫猪只后生长活动状况和饮食饮水状态均未出现异常情况,组织器官病理切片均未观察到明显的病变特征;q RT-PCR实验结果显示重组候选疫苗在猪体内复制能力有限,不超过10天,且不存在病毒外排的风险;免疫组化结果显示各主要器官组织NDV蛋白表达均为阴性。本实验结果表明两种重组候选疫苗免疫猪只后均具有良好的安全性。4. 重组NDV候选疫苗猪体免疫效果评价本实验分别从体液免疫水平（特异性中和抗体）、细胞免疫水平（细胞因子、淋巴细胞增殖、细胞亚群检测）和攻毒保护实验（体温监测、病毒残留检测）三个方面进行重组候选疫苗猪体免疫效果评价。结果显示重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5免疫原性较好,在加强免疫后第14天可刺激猪产生较高水平的特异性中和抗体（25.49±2.65）,诱导产生高浓度的IFN-γ（999.42 pg/m L）,总体明显优于r La Sota-GP5。与商品化疫苗相比（特异性中和抗体滴度:16.93±2.89;IFN-γ:450.49 pg/m L）,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5的体液和细胞免疫应答水平更为突出。攻毒保护实验结果显示,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可显著降低攻毒后猪只血液和部分器官组织中的病毒载量。本实验结果表明重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5具有较突出的免疫原性优势,可作为HP-PRRS防控的技术储备。5. 候选佐剂的制备、筛选及其免疫增强效果评价研究表明NDV抗原提呈水平呈现出负调控,而佐剂被认为具备相应的抗原提呈调节作用。为了进一步提升重组候选疫苗的免疫效果,本研究制备并筛选在NDV抗原提呈和小鼠免疫增强效果两方面均具有明显优势的配伍佐剂,并在猪体内评价配伍佐剂与重组候选疫苗的联合免疫增强效果。通过比较C57BL/6和BALB/c小鼠源DC的生长状态和抗原摄取提呈能力,筛选出适用于后续佐剂实验的DC来源。将四种中药配伍成分（TCM 1-4）均设置高、中、低三个剂量组别,分别基于商品佐剂（ISA 206）和中药佐剂（TCM-Main）制备两类配伍佐剂。评价商品配伍佐剂的均一稳定性和中药配伍佐剂的抗原摄取提呈水平,分别在小鼠体内检测两类配伍佐剂的免疫效果,筛选出优势佐剂,并在猪体内进行免疫增强效果验证。结果显示BALB/c小鼠源DC与同期的C57BL/6小鼠源DC具有相似的分化形态、NDV抗原摄取和提呈能力。商品配伍佐剂均具有良好的稳定性,粒径较为均一;B-4号中药配伍佐剂高剂量组可显著增强DC对NDV抗原的摄取和提呈能力。两类佐剂小鼠免疫评价结果显示,B-4号中药配伍佐剂高剂量组免疫小鼠后可刺激产生更高水平的特异性抗体和IFN-γ。猪体免疫评价结果显示,辅以高剂量B-4号佐剂的重组候选疫苗免疫增强效果更为突出,在攻毒后可降低猪器官组织中的病毒载量。本实验结果表明B-4号中药配伍佐剂可增强重组候选疫苗在猪体内的免疫效果,为今后猪体免疫中药佐剂的进一步研发优化奠定了基础。