RNA干扰沉默神经干细胞NgR基因、阻断Nogo-66抑制神经突生长作用的研究目的中枢神经系统损伤后的再生是世界性的难题。中枢神经系统髓鞘相关抑制因子包括Nogo-A，髓磷脂相关糖蛋白myelin- associated glycoprotein（MAG）和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白oligodendrocyte myelin glycoprotein（OMgp），它们都具有轴突生长抑制作用，在中枢神经系统神经再生的研究中倍受关注。研究表明Nogo蛋白分子羧基端两个跨膜区之间存在一个66个氨基酸的结构域Nogo-66，Nogo-66通过与Nogo-66受体（Nogo-66 Receptor，NgR）相结合具有重要的轴突生长抑制活性。MAG和OMgp也先后被发现是NgR的配体。在寻找NgR协同受体的研究中和直接结合试验都证实NgR是MAG的受体。Wang的研究表明NgR也是OMgp的受体。体外试验表明Nogo-66，MAG和OMgp的神经突生长抑制作用都通过NgR介导。NgR成为治疗脊髓损伤研究的焦点。神经干细胞移植是治疗脊髓损伤最有前途的方案之一，神经干细胞是否表达NgR及移植后的神经干细胞在其分化形成神经元的过程中是否受到脊髓损伤局部Nogo-66的影响目前尚未见报道。本研究检测了大鼠脊髓来源神经干细胞NgR的表达情况，在体外培养的神经干细胞分化过程中加入Nogo-66的活性片段Nogo-P4，显微测量神经元神经突长度，观察Nogo-66对神经干细胞分化形成的神经元神经突生长是否同样存在抑制作用，并进一步观察能否用RNAi的方法沉默神经干细胞NgR基因表达，阻断Nogo-66的抑制作用。实验方法一、实验动物生后24h内的Wistar大鼠由中国医科大学动物实验中心提供。二、主要试剂表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、NgR和nestin兔抗鼠单克隆抗体购自Chemicon公司，碱性成纤维细胞生长因子（basal fibroblast growth factor，bFGF）、DMEM／F12培养基、B27、PI、Alexa Fluor^? 488羊抗兔荧光二抗、Block-It Fluorescent Oligo、Lipofectamine 2000和Opti MEM I均购自Invitrogen公司。兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、胶质纤维酸性蛋白质（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗体均购自武汉博士德生物公司。Nogo-P4购自ADI公司。三、神经干细胞的培养和鉴定（一）细胞培养取4只出生24h内的Wistar大鼠，处死后在超净台内取出脊髓。将脊髓剪碎，胰酶消化后加入添加有B27、20ng／ml bFGF和20ng／ml EGF的DMEM-F12培养基，重悬浮，200目细胞筛过滤后接种于培养瓶中，置于37℃5％CO₂培养箱中悬浮培养。（二）Nestin免疫荧光染色培养2周后，取神经球固定后，以nestin兔抗鼠单克隆抗体标记，常规方法免疫荧光染色，荧光显微镜下观察照相。（三）诱导分化取神经球尽量吹打分散成单细胞，将神经干细胞悬液加入预先已置入玻璃盖片的6孔培养板中，加入10％胎牛血清。1周后取出盖片，分别以NSE，GFAP和MBP抗体标记，常规方法免疫荧光染色。四、NgR表达的检测培养2周后，取神经球固定后，以NgR兔抗鼠单克隆抗体标记，常规方法免疫荧光染色，荧光显微镜下观察照相。五、小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的设计和合成利用Invitrogen公司网上siRNA设计软件设计3条大鼠NgR mRNA的siRNA，由Invitrogen公司进行合成相应的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）。经预试验筛选出阻断NgR基因最有效的一条siRNA，其序列为：Sequence（5′to 3′）：-UGC AGU ACC UCU ACC UAC AAG ACA ASequence（5′to 3′）：-UUG UCU UGU AGG UAG AGG UAC UGC A六、实验分组将神经干细胞分为siRNA组，Nogo-P4组，siRNA+Nogo-P4组和对照组。对照组加入10％胎牛血清使神经干细胞开始分化；Nogo-P4组加入10％胎牛血清和4μmol／l的Nogo-P4；siRNA组的神经干细胞先经过siRNA转染，24h后加入10％胎牛血清开始分化；siRNA+Nogo-P4组的神经干细胞先经过siRNA转染，24h后加入10％胎牛血清和4μmol／l的Nogo-P4开始分化。七、siRNA的转染取1ml含神经干细胞的培养液加入离心管，800r／min离心5min，弃上清，加入900ul不含抗生素的培养基，机械吹打分散细胞，加入siRNA和转染试剂的混合物进行转染。24h和72h后检测NgR基因表达。另取部分神经干细胞以荧光标记的dsRNA（Block-It Fluorescent Oligo）进行相同条件下的转染，荧光显微镜下观察并计算转染效率。八、NgR基因沉默效率的检测（一）免疫荧光检测转染24h和72h后的神经干细胞固定后，加入NgR兔抗鼠单克隆抗体标记，常规方法免疫荧光染色，荧光显微镜下观察照相。每张盖片随机取10个视野，计数NgR阳性细胞数N和总细胞数T，计算阻断效率（T-N）／T。实验重复3次。（二）Western blot检测将培养液倒至15ml离心管中，1000rpm离心5min。弃上清，加入4ml PBS并轻轻吹打洗涤，然后1000rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。弃去上清，加400μl裂解液，冰上裂解30min。将裂解液4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。用Bradford法进行蛋白质定量。蛋白上样量30μg，上样前将样品于沸水中煮5min。电泳后转印到硝酸纤维素膜。5％的脱脂牛奶封闭非特异性背景，室温1h。将兔抗鼠NgR抗体用TBST稀释至1∶400，将膜放入一抗稀释液中，4℃过夜。用TBS在室温下洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育2h。用TBS在室温洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。用KPL公司的蛋白检测试剂盒显色。九、神经元神经突长度的测量神经干细胞分化第3d，以NSE抗体标记，常规方法免疫荧光染色，荧光显微镜下观察照相。使用Image-Pro Plus 5.0软件进行神经元细胞神经突长度的测量。十、统计分析实验数据以SPSS11.5软件进行处理，差异显著性采用单因素方差分析。实验结果悬浮培养的细胞形成典型的神经球，经免疫荧光检测nestin和NgR表达阳性。加入10％胎牛血清分化1周后，可观察到NSE，GFAP和MBP标记阳性的细胞。这表明培养出的神经球具备分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，是神经干细胞。NgR抗体标记染色后，分化前的神经球和散在的单细胞均呈现强表达。分化第3d，NgR表达阳性的细胞比率明显下降，只有（35.3±4.31）％的细胞NgR表达阳性。分化细胞的形态趋于成熟，可以识别出部分具有典型形态的神经元和胶质细胞。经双重免疫荧光染色证实，NgR表达阳性的细胞均为NSE表达阳性的细胞，多数NgR⁺／NSE⁺的细胞具有典型的神经元形态，双极或多级，有较长的突起。分化第3d Nogo-P4组神经元神经突长度为80.54±6.75μm；对照组神经元神经突长度为97.80±6.97μm。Nogo-P4组和对照组神经元神经突长度有显著差异，P＜0.01。Nogo-P4组神经元神经突长度较对照组缩短约17％。siRNA组神经干细胞经siRNA转染后大部分神经干细胞存活，少量细胞死亡，存活的细胞活力良好，超过24h后不再出现细胞死亡。部分神经干细胞以荧光标记的dsRNA（Block-It Fluorescent Oligo）进行相同条件下的转染，在荧光显微镜下观察证实dsRNA已进入神经干细胞内，转染获得成功，转染效率为94.3％。转染后24h神经干细胞经NgR抗体标记染色，荧光显微镜下观察发现大量神经干细胞的NgR表达阴性，这表明RNA干扰可以引起NgR基因表达沉默。用随机打乱顺序的siRNA转染作为阴性对照，神经干细胞的NgR表达没有减弱，镜下显示为明亮的绿色荧光。Western blot检测的结果证实对照组和经随机打乱顺序的siRNA（scrambled siRNA）转染后24小时的神经干细胞NgR均显著表达，经siRNAC转染后24 h的神经干细胞NgR表达显著降低。转染后24h的NgR基因阻断效率为（90.35±3.1）％。转染后72h的NgR基因阻断效率为（89.96±3.9）％。分化第3d，siRNA组神经元神经突长度为92.14±7.27μm，siRNA+Nogo-P4组神经元神经突长度为94.01±8.37μm。siRNA组及siRNA+Nogo-P4组和对照组神经元神经突长度无显著差异；siRNA+Nogo-P4组和Nogo-P4组神经元神经突长度有显著差异，P＜0.01。结论1、大鼠脊髓来源神经干细胞显著表达NgR。2、在神经干细胞分化成神经元的过程中始终表达NgR。3、神经干细胞分化过程中神经元的神经突生长会受到Nogo-P4的抑制。4、Nogo-P4的神经突生长抑制作用随浓度升高而升高，在4μm／L时达到最大抑制作用。5、RNA干扰的方法能够高效率地使神经干细胞的NgR基因表达沉默。6、NgR基因表达沉默能够阻断Nogo-P4的神经突生长抑制作用。