甾体药物具有显著的抗过敏、抗感染、抗休克等生理和药理功能,其在消炎及内分泌调控等方面属刚需用药,市场前景十分广阔。我国是全球甾体激素药物的生产大国,也是世界上最大的甾体原料药生产国,其中70%用于出口,年产值超百亿元。雄烯二酮（AD）作为甾体药物核心原料药可合成绝大部分甾体激素类药物。以植物甾醇为底物,微生物转化技术体系的建立,为AD的工业化生产奠定了坚实基础。新金分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum）具有较强的植物甾醇代谢能力,现已被改造成为重要的AD工业生产菌株。M.neoaurum转化植物甾醇生产AD的过程,是由多种辅因子参与的复杂代谢过程,其主要代谢步骤为植物甾醇侧链的类β氧化降解过程。生产菌株对植物甾醇的转运效率和溶解氧的供应是AD高效生产的主要限制因素。本文以AD生产菌株Mycobacterium sp.LZ2（Msp）为研究对象,利用基因工程手段,通过提高菌株对植物甾醇转运能力和胞内溶解氧供给,达到提高AD生产效率的目的。分枝杆菌依靠Mce4转运体实现对植物甾醇的摄取。Mce G为Mce4提供能量对植物甾醇的主动运输发挥重要作用。在Msp中共同表达密码子优化的Vitreoscilla血红蛋白（VHb）和甾醇转运ATP酶（Mce G）基因。对串联重组菌株Msp-vgb/mce G生产性能的研究表明:Mce G和VHb基因串联表达可促进该菌株的生长、生物转化能力和对溶解氧限制的适应性;能够通过提高细胞内过氧化氢酶的活性来降低细胞内的ROS水平,以确保重组菌株能够获得较高的细胞活力。对甾醇代谢多种关键酶基因的转录水平的研究结果表明,与Msp相比,Msp-vgb/mce G中甾醇转运、侧链降解和丙酰辅酶A代谢相关基因的表达水平在48和72小时时上调。其中,mce G在48 h的表达上调最为明显,是Msp的6.76倍,表明mce G得到有效表达。采用固定化重复分批发酵方式,以甘蔗渣作为固定化载体。当甘蔗渣用量为5 g/L时,Msp-vgb/mce G的转化率达到93.45%,是最佳的使用量。以5 g/L甘蔗渣为固定化载体进行固定化重复批次发酵。实验结果表明:与单批次固定化发酵相比,固定化重复批次发酵可将总发酵时间由60天缩短到37天,平均转化效率为0.069 g/L/h,是游离细胞（0.039 g/L/h）的1.77倍。固定化重复分批发酵可使产物生成的周期提前,提高了生产效率和植物甾醇转化率,进一步提高了AD产量。