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柿果属于跃变型果实，采收后极易软化，给柿果的贮藏运输带来不便。大量研究证实，乙烯是跃变型成熟果实的催熟激素。跃变型果实中自我催化的乙烯合成反应启始后，合成大量乙烯。利用转基因技术抑制或降低果实乙烯的生物合成，可以降低果实乙烯的含量。ACC合成酶和ACC氧化酶是果实乙烯生物合成的限速酶，通过转基因的方法抑制这两种酶的表达，可望提高跃变型果实的耐贮性能。本研究以柿果实为材料，克隆分离了富有柿ACC氧化酶基因，成功构建了该基因的反义和RNA干扰表达载体，结果如下：1．利用Rneasy? Plant Mini Kit试剂盒成功提取了高质量的RNA，RNA的OD260／OD280比值为2.0979，为mRNA的反转录奠定了基础。2．mRNA的反转录采用了QIAGEN公司的反转录试剂盒(OmniscriptTM RT Kit)，分离到完整性好的mRNA，为继后的RT-PCR提供可靠保证。3．根据已发表的平核无柿ACC氧化酶的保守氨基酸序列，设计了一对特异性引物，进行RT-PCR扩增，得到一个长592bp的cDNA片段，经序列分析证明该片段具有ACC氧化酶的保守区氨基酸序列，与GenBank中平核无柿果的DK-ACO1基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性达98％，说明克隆到的片段是富有柿果ACC氧化酶基因片段。4．通过分析已获得ACC氧化酶基因片段，在内含子两端分别设计含有EcoRV酶切位点的引物，通过酶切将两个PCR扩增产物连接成一条基因片段，并转化到大肠杆菌DH5a中经过鉴定及测序，证明得到了去除内含子的基因片段。5．用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ酶切克隆到的富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列和pBI221质粒载体，将ACC氧化酶的序列反向克隆到了pBI221质粒中，构建成中间表达载体pBI-anti-ACO。6．用SmaⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI-anti-ACO和pSMAK311质粒，切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和ACO的反义序列，将其插入到切除CaMV 35S启动子的pSMAK311质粒中，构建成反义表达载体pSMAK-anti-ACO。7．用BamHⅠ和SmaⅠ分别酶切反义中间表达载体质粒pBI-anti-ACO和富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列，将ACC氧化酶的序列正向插入到中间载体pBI-anti-ACO质粒中，构建成中间表达载体pBI-ACO-RNAi。8．用SmaⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI-ACO-RNAi和pSMAK311质粒，切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和ACO的反义、正义序列，将其插入到切除CaMV 35S启动子的pSMAK311质粒中，构建成RNAi植物表达载体pSMAK-ACO-RNAi。9．利用冻融法将pSMAK-anti-ACO、pSMAK-ACO-RNAi两个表达载体转化到农杆菌EHA101中，经特异性引物对转化菌液进行PCR扩增，证实表达载体已转入农杆菌。