论文部分内容阅读
手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种由多种肠道病毒引起的急性传染病,主要感染5岁以下婴幼儿,临床表现为手、足、口等部位发生皮疹、疱疹,严重时可导致脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿甚至死亡。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒 A 组 16 型(Coxsackievirus A16,CA16)为引起手足口病的两种主要病原体。以往的报道显示,手足口病的严重病例主要由EV71引起,但越来越多的流行病学调查表明,CA16引起的症状不再是温和的,也可引起严重的神经系统并发症,甚至导致死亡。目前CA16疫苗的研究还没有取得突破性进展,尚无进入临床试验阶段的报导,并且EV71疫苗对CA16感染也没有保护作用。因此,CA16疫苗对手足口病的全面防控具有重要的意义。减毒活疫苗的研究是CA16疫苗研究的一个方向,而冻干剂型的是又是研究的重点。因此,本论文主要针对CA16减毒活疫苗生产的抽提纯化工艺、冻干工艺等关键工艺进行深入研究,并对抽提纯化工艺和冻干工艺进行系统评价,为今后冻干CA16减毒性疫苗的研发奠定基础。氯仿抽提纯化工艺结果发现PBS洗涤液浓度分别为2.0 mmol/L、6.2 mmol/L、10.0mmol/L,病毒液与氯仿体积比分别为1:2、1:1、2:1以及PBS洗涤液洗涤3次或5次对病毒感染性滴度均无明显影响,病毒回收率平均为81.7%;随着PBS洗涤次数的增多,洗液中的杂蛋白逐渐减少,不同病毒液与氯仿体积比及不同PBS缓冲液离子浓度对蛋白去除率没有明显的影响,蛋白去除率均大于82%,平均去除率88.37%;不同病毒液与氯仿的抽提体积比、不同PBS洗涤液浓度及PBS洗涤3次或5次对残余卡那霉素含量无明显影响,结果均低于30 ng/ml,经超滤浓缩后,其含量低于3 ng/ml;氯仿抽提纯化残余BSA的去除率可达68.87%以上,若结合超滤浓缩工艺,残余BSA的去除率可达94.74%;超滤浓缩后纯化病毒液残余氯仿去除率可达98%以上,最终纯化液残余氯仿含量小于6 μg/ml。冻干工艺结果表明,最优的冻干保护剂为无明胶保护剂B,就保护剂B而言,最优的冻干程序为程序1。使用无明胶的保护剂B和冻干程序1进行冻干,发现冻干后产品滴度均在5.25 lgCCID50/ml以上,滴度降为1.25 lgCCID50/ml～2.38 lgCCID50/ml。产品残余水分检测结果为1.29%～1.54%,残余氯仿为7.5μg/ml。免疫小鼠后,可以引起小鼠产生较好的体液免疫应答,能产生较高的中和抗体,GMT值为1:111.43。过敏实验、异常毒性实验和急性毒性试验结果均符合《中国药典》的相关要求,说明实验性CA16冻干疫苗的研究基本达到了预期目标。本研究获得了 CA16减毒活疫苗最优的保护剂配方、相对较优的冻干程序以及CA16病毒氯仿抽提纯化的条件,并对冻干产品进行了滴度、免疫原性、过敏实验以及异常毒性实验等评价,相关结果均符合《中国药典》的相关要求,为CA16减毒活疫苗的研发奠定了基础。